Huidige†Huidige adres: OX11 0DE, VK, Diamond-gebou, Harwell Wetenskap- en Innovasiepark, Dietcote, Oxfordshire, VK, Diamond Light Source Co., Ltd., Elektroniese Biologiese Beeldingsentrum.
Die reaksiesentrum-lig-oeskompleks 1 (RC-LH1) is die kern fotosintetiese komponent van pers fototrofiese bakterieë. Ons het twee krio-elektronmikroskopiestrukture van die RC-LH1-kompleks van Rhodopseudomonas palustris bekendgestel. Die 2.65-Å-resolusiestruktuur van die RC-LH114-W-kompleks bestaan ​​uit 14 subeenheid LH1-lusse wat RC omring, wat deur proteïen W onderbreek word, terwyl die kompleks sonder proteïen-W volledig RC-samestelling is, omring deur RC. Geslote 16 subeenheid LH1-lus. Die vergelyking van hierdie strukture bied insigte in die dinamika van kinoon in die RC-LH1-kompleks, insluitend voorheen onbepaalde konformasieveranderinge wanneer kinoon by die RC QB-plek gebind word, sowel as die ligging van hulpkinoonbindingsplekke, wat help om hulle na RC oor te dra. Die unieke struktuur van die W-proteïen verhoed die sluiting van die LH1-lus, waardeur 'n kanaal geskep word vir die versnelling van die kinoon/kinoloon-uitruiling.
Die energie wat deur fotosintese verskaf word, kan byna alle lewe op aarde onderhou, en dit het groot potensiaal vir sonbiotegnologie. Terwyl dit globale fotosintese bevorder, vertoon pers fototrofiese bakterieë ook verskeie energiemodusse en metaboliese vermoëns. Hulle kan fotosintese vermy en as heterotrofiese bakterieë in die donker groei, stikstof en koolstofdioksied vasmaak, waterstof produseer en aromatiese verbindings afbreek (1-3). Om energie vir hierdie prosesse te verskaf, moet lig vinnig en doeltreffend in chemiese energie omgeskakel word. Hierdie proses begin wanneer die ligvangende antennakompleks lig absorbeer en die vasgevangde energie na die reaksiesentrum (RC) oordra, waardeur ladingskeiding begin word (4-7). Die basiese eenheid van fotosintese in pers fototrofiese bakterieë bestaan ​​uit tipe 2 RC, omring deur lig-oeskompleks 1 (LH1), wat die RC-LH1-kernkompleks vorm. LH1 word gevorm deur 'n skikking van geboë αβ heterodimere, wat elk twee bakteriese chlorofil (BChl) a-molekules en een of twee karotenoïede bind (8-12). Die eenvoudigste LH1-antenna bestaan ​​uit 16 of 17 αβ-heterodimere wat RC (9-13) in 'n geslote lus omring, maar in ander kernkomplekse onderbreek transmembraanpeptiede die kontinuïteit van die omliggende LH1, waardeur die kinol/kinoon-diffusie tussen RC en die sitochroom bc1-kompleks bevorder word (11, 13-15). Die pers fototrofiese plant Rhodopseudomonas (Rps.) is 'n modelorganisme wat die energie- en elektronoordrag wat fotosintese ondersteun, kan verstaan. Die eerste kristalstruktuur van Rps. Die model van die palustris RC-LH1-kompleks is RC, omring deur 15 heterodimeriese LH1-lusse, wat onderbreek word deur 'n onbekende proteïen genaamd "Proteïen W" (14). Proteïen-W is vervolgens geïdentifiseer as RPA4402, wat 'n ongekarakteriseerde 10.5 kDa proteïen met drie voorspelde transmembraanhelikse (TMH) is (16). Ons stel voor om die rpa4402-geen wat vir proteïen W kodeer, na pufW te hernoem om konsekwent te wees met die nomenklatuur wat gebruik word vir gene wat vir RC-L, M (pufL, pufM) en LH1α, β (pufA, pufB) subeenhede kodeer. Interessant genoeg is proteïen-W slegs teenwoordig in ongeveer 10% van RC-LH1, wat onthul dat Rps. palustris twee verskillende RC-LH1-komplekse produseer. Hier rapporteer ons die hoëresolusie krio-EM (krio-EM) strukture van twee kernkomplekse, een met proteïen W en 14 αβ heterodimere, die ander sonder proteïen W en 'n geslote 16 Heterodimeer LH1-lus. Ons struktuur verteenwoordig 'n stapsgewyse verandering in die begrip van die RC-LH1-kompleks van Rps. palustris, omdat ons die homogene populasie van elke variant geanaliseer het en voldoende resolusie het om elke peptied en gebonde pigmente en verwante lipiede en kinone duidelik toe te ken. Die vergelyking van hierdie strukture toon dat die drie TMH-proteïene-W wat tot dusver nie in enige ander RC-LH1-kompleks gevind is nie, 'n kinoonkanaal genereer om die kinoon/kinoloon-uitruiling te versnel. 'n Aantal gekonserveerde lipied- en kinoonbindingsplekke is geïdentifiseer, en ons het 'n nuwe konformasieverandering na die kombinasie van kinoon en RC onthul, wat geskik mag wees vir fotosisteem II (PSII) RC van suurstofryke fototrofiese organismes. Ons bevindinge bied nuwe insigte in die kinetika van kinoon/kinoloonbinding en -uitruiling in die RC-LH1-kernkompleks van pers fototrofiese bakterieë.
Om 'n gedetailleerde studie van die twee komplekse wat in Rps. palustris gevind word, te vergemaklik, isoleer ons elke RC-LH1 deur biochemiese metodes. Die proteïen W-gebrekkige kompleks (hierna verwys as ΔpufW) is gesuiwer van die stam wat die pufW-geen kortkom (16), en slegs een RC-LH1-kompleks kan geproduseer word. Die proteïen W-bevattende kompleks word deur 'n stam geproduseer. Die proteïen W van hierdie stam word gemodifiseer met 'n 10x His-merker by sy C-terminus, sodat die proteïen W-bevattende kompleks effektief gekombineer kan word met die meeste ontbrekende proteïen W deur metaal te immobiliseer. Die kompleks word effektief geskei (16) Affiniteitschromatografie (IMAC).
Soos getoon in Figuur 1, bevat beide komplekse 'n drie-subeenheid RC (RC-L, RC-M en RC-H) omring deur 'n LH1-antenna. Die 2.80-A-struktuur van die kompleks wat proteïen-W ontbreek, toon 16 αβ-heterodimere, wat 'n geslote LH1-lus vorm wat RC heeltemal omring, hierna verwys as die RC-LH116-kompleks. Die 2.65Å-struktuur van die proteïen-W-bevattende kompleks het 'n 14-heterodimeer LH1 onderbreek deur proteïen-W, hierna verwys as RC-LH114-W.
(A en B) Oppervlakvoorstelling van die verbinding. (C en D) Gebonde pigmente uitgedruk in stafies. (E en F) Die komplekse wat vanaf die sitoplasmiese oppervlak waargeneem word, het die peptiede en LH1-subeenhede wat in die spotprente voorgestel word, en is kloksgewys genommer vanaf die proteïen-W-gaping [ooreenstemmend met Rba-nommering. sphaeroides-kompleks (13)]. Vir LH1-α is die kleur van die proteïensubeenheid geel; vir LH1-β is die kleur van die proteïensubeenheid blou; vir proteïen-W is die proteïen rooi; vir RC-H is dit siaan; vir RC-L is dit oranje; vir RC-M, magenta. Kofaktore word deur stafies voorgestel, groen verteenwoordig BChl- en BPha-molekules, pers verteenwoordig karotenoïede, en geel verteenwoordig UQ10-molekules. (G en H) Vergrote aansig van die proteïen-W-gaping in die ekwivalente gebied van RC-LH114-W-kompleks (G) en RC-LH116-kompleks (H). Kofaktore word in die vorm van ruimtevulling vertoon, gecheleerde kinon word in blou vertoon. Die proteïen-W-gaping word uitgelig deur 'n blou stippellyn in (G), en die klein gaatjies waar kinon/kinolol op die LH116-ring diffundeer, word uitgelig deur 'n swart stippellyn in (H).
Figuur 1 (A en B) toon die RC omring deur oop of geslote skikkings van LH1αβ heterodimere, wat elk twee BChl en een karotenoïed bind (Figuur 1, C en D). Vorige studies het getoon dat Rps die LH1-kompleks is. In die biosintetiese pad van spirulina xantien bevat hierdie spesies gemengde populasies van karotenoïede (17). Spiropirroksantien is egter die dominante karotenoïed en die digtheid daarvan is bevredigend. Daarom het ons gekies om spiroksantien by alle LH1-bindingsplekke te modelleer. Die alfa- en beta-polipeptiede is enkele TMH's met kort membraan-buitenste streke (Figuur 1, A, B, E en F). Alhoewel die digtheid van 17 residue by die C-terminus nie waargeneem is nie, is die alfa-polipeptied in beide komplekse van Met1 na Ala46 gesplyt. β-polipeptied is van Gly4 na Tyr52 in RC-LH116 gereduseer, en van Ser5 na Tyr52 in RC-LH114-W. Geen digtheid van 3 of 4 N-terminale of 13 C-terminale residue is waargeneem nie (Figuur S1). Massaspektrometrie-analise van die gemengde RC-LH1-kompleks wat uit die wildetipe-stam voorberei is, het getoon dat die ontbrekende gebied die gevolg was van heteroloë splitsing van hierdie peptiede (Figuur S1 en S2). Die N-terminale formilering van α-Met1 is ook waargeneem (f). Die analise het getoon dat die α-peptied bestaan ​​uit residue fMet1 tot Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, en die β-peptied bestaan ​​uit residue Ser2 tot Ala53, wat in goeie ooreenstemming is met die lae-temperatuur EM-digtheidskaart.
Koördinasie van α-His29 en β-His36 maak BChls van aangesig tot aangesig; elke αβ heterodimeer versamel met sy bure om 'n oop lus (RC-LH114-W) of 'n geslote lus (RC-LH116) rondom die RC te vorm. Die eksiton-gekoppelde pigmentskikking (Figuur 1, C en D). In vergelyking met die 877 nm-band van RC-LH114-W, is die 880 nm-absorpsie-rooiverskuiwing van RC-LH116 3 nm (Figuur 2A). Die sirkelvormige dichroïsmespektrum is egter amper dieselfde (Figuur 2B), wat aandui dat hoewel daar 'n duidelike verskil tussen oop en geslote lusse is, die plaaslike omgewing van BChls baie soortgelyk is. Die absorpsie-rooiverskuiwing kan die gevolg wees van verminderde termiese beweging en verhoogde stabiliteit op die geslote lus (18, 19), die verandering in pigmentkoppeling wat deur die geslote lus veroorsaak word (20, 21), of 'n kombinasie van hierdie twee effekte (11).
(A) Ultraviolet/sigbare/naby-infrarooi absorpsiespektrum, waarvan die pieke met hul ooreenstemmende pigmente gemerk is en genormaliseer is na die BPh-piek by 775 nm. (B) Sirkulêre dichroïsmespektrum genormaliseer na BChl-absorpsie by 805 nm. (C en D) Geselekteerde ΔA-spektra uit die tydopgeloste absorpsiespektra van die RC-LH114-W-kompleks (C) en RC-LH116-kompleks (D). Vir beter vergelyking is alle spektra genormaliseer na ∆A van −A teen 0.2 ps. (E) Die tempo van sitochroom c2-oksidasie na bestraling in die teenwoordigheid van verskillende konsentrasies van UQ2 (sien Figuur S8 vir rou data). (F) In selle wat gekweek is onder lae-, medium- of hoë-intensiteit lig (onderskeidelik 10, 30 of 300 μMm-2 s-1), die proteïen W- en RC-L-subeenhede in die gesuiwerde kompleks en die geskeide membraanverhouding. Bepaal die proteïenvlak deur SDS-poliakrielamiedgelelektroforese en immunoassay (sien Figuur S9 vir rou data). Bepaal die verhouding relatief tot die gesuiwerde RC-LH114-W-kompleks. Die stoïgiometriese verhouding van RC-L tot proteïen-W van die kompleks is 1:1.
Die BChls by posisie 1 in die vervormde αβ14-lus van RC-LH114-W (Figuur 1, A, C en E) is 6.8 Å nader aan die RC primêre skenker (P) as die ekwivalente BChls in RC-LH116 (Figuur 1, B, D en F, en Figuur S3); die oorgangsabsorpsiekinetika van die twee komplekse toon egter dat vir RC-LH114-W en RC-LH116, die opwekkingsenergie-oordragtydkonstantes van LH1 na RC 40 ±4 en 44 ±3 ps is (Figuur 2, C en D, Figuur S4 en Tabel S2). Daar is ook geen beduidende verskil in elektroniese oordrag binne RC nie (Figuur S5 en verwante aanvullende teks). Ons vermoed dat die noue ooreenstemming van die energie-oordragtyd tussen LH1 en RC-P te wyte is aan die soortgelyke afstand, hoek en potensiële energie van die meeste BChl in die twee LH1-lusse. Dit wil voorkom asof die verkenning van die LH1-energiepatroon om die minimum afstand te bereik nie vinniger is as direkte energie-oordrag vanaf suboptimale plekke na RC nie. Die ooplus LH1-lus in RC-LH114-W kan ook onbeduidende termiese beweging onder lae temperatuurtoestande ondergaan vir strukturele analise, en daar is 'n langer αβ14-ringkonformasie by kamertemperatuur vanaf die pigmentasie-afstand van βBChls by die posisie van RC 1.
Die RC-LH116-kompleks bevat 32 BChl's en 16 karotenoïede, en die algehele rangskikking daarvan is dieselfde as dié wat verkry is van Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970-stam (PDB ID 7C9R) (12) en groen alge (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Na belyning is slegs klein afwykings in die posisies van αβ-heterodimere waargeneem, veral 1-5, 15 en 16 (Figuur S6). Die teenwoordigheid van proteïen-W het 'n beduidende impak op die struktuur van LH1. Die drie TMH's is verbind deur kort lusse, met die N-terminaal aan die lumenkant van die kompleks en die C-terminaal aan die sitoplasmiese kant (Figure 1A en 3, A tot D). Proteïen-W is grootliks hidrofobies (Figuur 3B), en TMH2 en TMH3 tree in wisselwerking met LH1αβ-14 om 'n transmembraanoppervlak te vorm (Figuur 3, B en E tot G). Die koppelvlak bestaan ​​hoofsaaklik uit Phe-, Leu- en Val-residue in die transmembraangebied. Hierdie residue is gestapel met hidrofobiese aminosure en αβ-14-pigmente. Sommige polêre residue dra ook by tot die interaksie, insluitend die waterstofbinding tussen W-Thr68 en β-Trp42 op die oppervlak van die komplekse holte (Figuur 3, F en G). Op die oppervlak van die sitoplasma is Gln34 aangrensend aan die ketogroep van αβ-14-karotenoïede. Daarbenewens is die n-dodeksiel β-d-maltosied (β-DDM)-molekule opgelos, en die hidrofobiese stert daarvan het uitgebrei na die koppelvlak tussen proteïen-W en αβ-14, en die lipiedstert kan in die liggaam geleë wees. Ons het ook opgemerk dat die C-terminale resolusiestreke van proteïen W en RCH baie naby aan mekaar is, maar nie binne die bestek van die vorming van spesifieke interaksies nie (Figuur 1, A en E). Daar kan egter interaksies in die onopgeloste C-terminale aminosure van hierdie twee proteïene wees, wat 'n meganisme vir die werwing van proteïen-W tydens die samestelling van die RC-LH114-W-kompleks kan bied.
(A) Proteïen-W, wat in spotprentvorm na die koppelvlak met LH1αβ14 wys, het 'n staafvormige syketting (rooi), wat in 'n deel van die elektrostatiese potensiaaldiagram vertoon word (deursigtige grys oppervlak met 'n kontoervlak van 0.13). (B) Proteïen-W word voorgestel deur 'n hidrofobiese gekleurde oppervlak. Polêre en gelaaide areas word in siaan vertoon, hidrofobiese areas word in wit vertoon, en sterk hidrofobiese areas word in oranje vertoon. (C en D) Proteïen-W word in die spotprent voorgestel, die oriëntasie daarvan is dieselfde as in (A) (C), en geroteer met 180° (D). Volgens die posisie in die volgorde neem die onderskeibare residue 'n reënboogkleurskema aan, waar die N-terminaal blou en die C-terminaal rooi is. (E) Proteïen-W in dieselfde aansig as in (A), en die residue by die koppelvlak van proteïen-W:LH1 word voorgestel deur stafies met aangehegte merke. (F) Proteïen-W word 90° geroteer relatief tot (E) en LH1αβ14 in die spotprentvoorstelling, en relatief tot die koppelvlakresidue in die staafvoorstelling. Die oorhangende residue van die beta-polipeptied word gemerk. Die kofaktor word getoon as 'n staaf wat ooreenstem met die kleur van Figuur 1, die ontbinde β-DDM word in grys getoon, en die suurstof word in rooi getoon. (G) Die aansig in (F) word 180° geroteer, met die prominente residue van die gemerkte alfa-polipeptied.
Proteïen-W vervang 'n αβ heterodimeer (die 15de in Figuur 1F), waardeur lussluiting voorkom word en die eerste drie αβ heterodimere gekantel word. Daar is waargeneem dat die maksimum hellingshoek van die eerste αβ-1 heterodimeer relatief tot die filmnormaal 25° tot 29° was (Figuur 1, A en E), wat gevorm is deur die 2° tot 8° helling van αβ-1 in RC A skerp kontras-LH116 (Figuur 1, B en F). Die tweede en derde heterodimere is onderskeidelik teen 12° tot 22° en 5° tot 10° gekantel. As gevolg van die steriese hindernis van RC, sluit die kanteling van αβ-1 nie die tweede paar αβ in nie (wat ooreenstem met die 16de αβ in Figuur 1F), wat dus 'n duidelike gaping in die LH1-ring vorm (Figuur 1, A en E). As gevolg van die gebrek aan twee αβ-heterodimere, gepaardgaande met die verlies van vier BChl en twee karotenoïede, bind geeneen van die karotenoïede aan die gedraaide αβ-1-subeenheid nie, wat lei tot 'n LH114-W-ring wat 13 vegetariese karotenoïede en 28 BChl's bevat. Die plaaslike resolusieberamings van die twee komplekse in die αβ1 tot 7 streke is laer as dié van die res van die LH1-lus, wat die inherente plastisiteit van die LH1-subeenheid aangrensend aan die RC QB-plek kan weerspieël (Figuur 4).
Die prente van RC-LH114-W (A en B) en RC-LH116 (C en D) word vanuit dieselfde bo-aansig/sy-aansig (A en B) (A en C) en holte-oppervlak van Fig. 1 (B en D) getoon. Die gekleurde sleutels word aan die regterkant getoon.
Die enigste ander kenmerkende kernkompleks met 'n stoïgiometriese verhouding van 1:14 is die Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimeer (13). Proteïen W en PufX het egter geen ooglopende homologie nie en het 'n beduidende impak op hul onderskeie LH1-strukture. PufX is 'n enkele TMH met 'n N-terminale sitoplasmiese domein wat interaksie het met die sitoplasmiese kant van die RC-H-subeenheid (13) by 'n posisie wat ooreenstem met Rps. palustris LH116αβ-16. PufX skep 'n kanaal vir die kinoon/kinoloon-uitruiling tussen RC-LH1 en die sitochroom bcl-kompleks en is teenwoordig in alle Rba. sphaeroides kernkompleks (13). Alhoewel die monomeer-monomeer-koppelvlak in Rba is. Die sphaeroides RC-LH1-PufX dimeer is geleë by die bindingsposisie van proteïen W in RC-LH114-W, en die gaping wat deur PufX en proteïen-W geïnduseer word, is by 'n ekwivalente posisie (Figuur S7A). Die gaping in RC-LH114-W is ook in lyn met die hipotetiese kinoonkanaal (8) van Pseudomonas rosea LH1, wat gevorm word deur peptiede wat nie verwant is aan proteïen W of PufX nie (Figuur S7B). Daarbenewens is die kinoonkanaal in Blc. Die smaraggroen LH1 wat gevorm word deur een γ-subeenheid (7) uit te sluit, is in 'n soortgelyke posisie geleë (Figuur S7C). Alhoewel dit deur verskillende proteïene gemedieer word, blyk die verskyning van hierdie kinoon/kinololkanale in 'n gemeenskaplike posisie in die RC-LH1-kompleks 'n voorbeeld van konvergente evolusie te wees, wat aandui dat die gaping wat deur proteïen W geskep word, as 'n kinoonkanaal kan optree.
Die gaping in die LH114-W-lus laat die vorming van 'n deurlopende membraangebied tussen die interne ruimte van die RC-LH114-W-kompleks en die bulkmembraan toe (Figuur 1G), eerder as om die twee domeine deur 'n proteïenporie te verbind soos in proteïene. Die RC-LH116-kompleks is soortgelyk aan 'n geslote Tch. Naaldagtige kompleks (22) (Figuur 1H). Aangesien die diffusie van kinoon deur die membraan vinniger is as die diffusie deur die nou proteïenkanaal, kan die oop LH114-W-lus vinniger RC-omset toelaat as die geslote LH116-lus, en die diffusie van kinoon in die RC kan meer beperk wees. Om te toets of proteïen W die omskakeling van kinone deur RC beïnvloed, het ons 'n sitochroomoksidasie-toets op 'n sekere konsentrasie ubikwinoon 2 (UQ2) ('n analoog van natuurlike UQ10 met 'n korter isopreenstert) uitgevoer (Figuur 2E). Alhoewel die teenwoordigheid van gecheleerde kinoon die akkurate bepaling van die skynbare Michaelis-konstante belemmer (RC-LH114-W en RC-LH116 is geskik vir onderskeidelik 0.2±0.1μM en 0.5±0.2μM), is die maksimum tempo van RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) 28±5% groter as RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Ons het aanvanklik beraam dat proteïen-W teenwoordig is in ongeveer 10% van die kernkompleks (16); hier is die besettingskoerse van lae-lig, medium-lig en hoë-lig groeiselle onderskeidelik 15±0.6%, 11±1% en 0.9±0.5% (Figuur 2F). Kwantitatiewe vergelyking van massaspektrometrie het getoon dat die byvoeging van histidien-etiket nie die relatiewe oorvloed van proteïen-W verminder het in vergelyking met wildetipe-stamme nie (P = 0.59), dus is hierdie vlakke nie 'n artefak van gemodifiseerde proteïen-W nie (Figuur S10). Hierdie lae besettingskoers van proteïen-W in die RC-LH1-kompleks kan egter toelaat dat sommige RC's teen 'n versnelde tempo omskakel, waardeur die stadiger kinoon/kinoloon-uitruiling in die RC-LH116-kompleks verminder word. Ons het opgemerk dat die hoë ligbesettingskoers teenstrydig is met die onlangse transkriptomika-data, wat aandui dat pufW-geenuitdrukking onder sterk lig toeneem (Figuur S11) (23). Die verskil tussen pufW-transkripsie en proteïen-W-inlywing in die RC-LH1-kompleks is verwarrend en kan die komplekse regulering van die proteïen weerspieël.
In RC-LH114-W word 6 kardiolipien (CDL), 7 fosfatidielcholien (POPC), 1 fosfatidielgliserol (POPG) en 29 β-DDM molekules toegeken en daarin gemodelleer: 6 CDL's, 24 POPC's, 2 POPG's en 12 βDDM's. RC-LH116 (Figuur 5, A en B). In hierdie twee strukture is CDL amper aan die sitoplasmiese kant van die kompleks geleë, terwyl POPC, POPG en β-DDM meestal aan die luminale kant geleë is. Twee lipied- en detergentmolekules is in die αβ-1 tot αβ-6-streek van die RC-LH114-W-kompleks geïsoleer (Figuur 5A), en vyf is in die ekwivalente streek van RC-LH116 geïsoleer (Figuur 5B). Meer lipiede is aan die ander kant van die kompleks gevind, hoofsaaklik CDL, wat tussen RC en αβ-7 tot αβ-13 opgehoop het (Figuur 5, A en B). Ander struktureel opgeloste lipiede en detergente is buite die LH1-ring geleë, en goed opgeloste asielkettings strek tussen LH1-subeenhede, tentatief aangewys as β-DDM in RC-LH114-W, en gedefinieer as β-DDM in RC 'n mengsel van β-DDM en POPC-LH116. Die soortgelyke posisies van chelerende lipiede en detergente in ons struktuur dui daarop dat hulle fisiologies relevante bindingsplekke is (Figuur S12A). Die posisies van ekwivalente molekules in Tch het ook goeie konsekwentheid. Gentle en Trv. Stam 970 RC-LH1s (Figuur S12, B tot E) (9, 12) en die waterstofbindingsresidue van die lipiedkopgroep het redelik goeie bewaring in die volgordebelyning getoon (Figuur S13), wat aandui dat gekonserveerde CDL wat aan RC (24) bind, hierdie plekke moontlik in die RC-LH1-kompleks gekonserveer kan wees.
(A en B) RC-LH114-W (A) en RC-LH116 (B) peptiede word deur tekenprente voorgestel, en die pigmente word deur stafies voorgestel, met behulp van die kleurskema in Figuur 1. Lipiede word in rooi getoon, en skoonmaakmiddels word in grys getoon. UQ gebind aan RC QA- en QB-plekke is geel, terwyl geïsoleerde UQ blou is. (C en D) Dieselfde aansigte as (A) en (B), met lipiede weggelaat. (E na G) Vergrote aansig van Q1(E), Q2(F) en Q3(G) van RC-LH116, met sykettings wat mekaar beïnvloed. Die waterstofbindings word as swart stippellyne getoon.
In RC-LH116 word beide RC QA en QB UQ, wat deelneem aan elektronoordrag in die ladingskeidingsproses, in hul bindingsplekke ontbind. In RC-LH114-W is QB-kinoon egter nie opgelos nie en sal hieronder in detail bespreek word. Benewens QA- en QB-kinone word twee gecheleerde UQ-molekules (geleë tussen die RC- en LH1-ringe) in die RC-LH114-W-struktuur toegeken volgens hul goed opgeloste kopgroepe (geleë in Q1 en Q2, onderskeidelik). Figuur 5C). Twee isopreeneenhede word aan Q1 toegeken, en die digtheidskaart los die volledige 10 isopreensterte van Q2 op. In die struktuur van RC-LH116 is drie gecheleerde UQ10-molekules (Q1 tot Q3, Figuur 5D) opgelos, en alle molekules het 'n duidelike digtheid dwarsdeur die stert (Figuur 5, D tot G). In die twee strukture het die posisies van die kinoon-kopgroepe van Q1 en Q2 uitstekende konsekwentheid (Figuur S12F), en hulle tree slegs in wisselwerking met RC. Q1 is geleë by die ingang van die W-gaping van RC-LH114-W (Figuur 1G en 5, C, D en E), en Q2 is geleë naby die QB-bindingsplek (Figuur 5, C, D) en F). Die gekonserveerde L-Trp143- en L-Trp269-residue is baie naby aan Q1 en Q2 en bied potensiële π-stapeling-interaksies (Figuur 5, E en F, en Figuur S12). L-Gln88, 3.0 Å vanaf die distale suurstof van Q1, bied 'n sterk waterstofbinding (Figuur 5E); hierdie residu word in alle RC's gekonserveer behalwe die mees verafgeleë verwantskap (Figuur S13). L-Ser91 word konserwatief vir Thr in die meeste ander RC's vervang (Figuur S13), is 3.8 Ångstrom vanaf die metielsuurstof van Q1, en kan swak waterstofbindings verskaf (Figuur 5E). Q3 blyk nie 'n spesifieke interaksie te hê nie, maar is geleë in die hidrofobiese gebied tussen die RC-M-subeenheid en die LH1-α-subeenheid 5 tot 6 (Figuur 5, D en G). Q1, Q2 en Q3 of nabygeleë gecheleerde kinone is ook opgelos in Tch. Gentle, Trv. Strain 970 en Blc. Die irisstruktuur (9, 10, 12) wys na 'n gekonserveerde hulpkinoonbindingsplek in die RC-LH1-kompleks (Figuur S12G). Die vyf ontbinde UQ's in RC-LH116 stem goed ooreen met die 5.8±0.7 van elke kompleks wat deur hoëprestasievloeistofchromatografie (HPLC) bepaal is, terwyl die drie ontbinde UQ's in RC-LH114-W laer is as. Die gemete waarde van 6.2±0.3 (Fig. S14) dui aan dat daar onopgeloste UQ-molekules in die struktuur is.
Die pseudo-simmetriese L- en M-polipeptiede bevat elk vyf TMH's en vorm 'n heterodimeer wat een BChl-dimeer, twee BChl-monomere, twee bakteriofaag (BPh)-monomere, en een nie-heem-yster en een of twee UQ10-molekules kombineer. Deur die teenwoordigheid van waterstofbindings op die terminale ketoongroep en die bekende akkumulasie daarvan in Rps, word karotenoïede in die M-subeenheid opgeneem, wat cis-3,4-dehidroorhodopien genoem word. Spesies (25). Die buitenste membraandomein van RC-H is deur 'n enkele TMH aan die membraan geanker. Die algehele RC-struktuur is soortgelyk aan die drie-subeenheid RC van verwante spesies (soos Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Die makrosiklusse van BChl en BPh, die karotenoïedruggraat en nie-heem-yster oorvleuel binne die resolusiebereik van hierdie strukture, net soos die UQ10-kopgroep by die QA-plek en die QB-kinoon by RC-LH116 (Figuur S15).
Die beskikbaarheid van twee RC-strukture met verskillende QB-plekbesettingstempo's bied 'n nuwe geleentheid om die konsekwente konformasieveranderinge wat met QB-kinonbinding gepaardgaan, te ondersoek. In die RC-LH116-kompleks is QB-kinon in die volledig gebonde "proksimale" posisie (26) geleë, maar die skeiding van RC-LH114-W het nie QB-kinon nie. Daar is geen QB-kinon in RC-LH114-W nie, wat verbasend is omdat die kompleks aktief is, meer so as die RC-LH116-kompleks met struktureel opgeloste QB-kinon. Alhoewel die twee LH1-ringe ongeveer ses kinone cheleer, is vyf struktureel opgelos in die geslote RC-LH116-ring, terwyl slegs drie struktureel beperk is in die oop RC-LH114-W-ring. Hierdie verhoogde strukturele wanorde kan die vinniger vervanging van RC-LH114-W QB-plekke, vinniger kinonkinetika in die kompleks en verhoogde waarskynlikheid om die LH1-lus oor te steek, weerspieël. Ons stel voor dat die gebrek aan UQ in die RC QB-plek van RC-LH114-W die gevolg kan wees van 'n meer komplekse en meer aktiewe kompleks, en die QB-plek van RC-LH114-W is onmiddellik gevries in UQ-omset. Die spesifieke stadium (die ingang na die QB-plek is gesluit) weerspieël die konformasie van hierdie aktiwiteit.
Sonder QB, die gepaardgaande rotasie van L-Phe217 na 'n posisie wat onversoenbaar is met UQ10-binding, omdat dit 'n ruimtelike botsing met die eerste isopreen-eenheid van die stert sal veroorsaak (Figuur 6A). Daarbenewens is die ooglopende hoofkonformasieveranderinge ooglopend, veral die heliks de (kort heliks in die lus tussen TMH D en E) waar L-Phe217 na die QB-bindingssakkie verskuif word en die rotasie van L-Tyr223 (Figuur 6A) om die waterstofbinding met die M-Asp45-raamwerk te breek en die ingang van die QB-bindingsplek te sluit (Figuur 6B). Heliks de draai by sy basis, die Cα van L-Ser209 word met 0.33 Å verskuif, terwyl die L-Val221Cα met 3.52 Å verskuif word. Daar is geen waarneembare veranderinge in TMH D en E nie, wat in beide strukture superponeerbaar is (Figuur 6A). Sover ons weet, is dit die eerste struktuur in die natuurlike RC wat die QB-plek sluit. 'n Vergelyking met die volledige (QB-gebonde) struktuur toon dat voordat die kinoon gereduseer word, 'n konformasieverandering nodig is om dit die kinoon te laat binnedring. L-Phe217 roteer om 'n π-stapeling-interaksie met die kinoon-kopgroep te vorm, en die heliks skuif na buite, wat die skelet van L-Gly222 en die syketting van L-Tyr223 toelaat om 'n waterstofbindingsnetwerk met 'n stabiele waterstofbindingsstruktuur te vorm (Figuur 6, A en C).
(A) Oorvleuelende spotprent van hologram (L-ketting, oranje/M-ketting, magenta) en apo (grys) struktuur, waarin die sleutelresidue in die vorm van 'n staafagtige voorstelling vertoon word. UQ10 word deur 'n geel staaf voorgestel. Die stippellyn dui die waterstofbindings aan wat in die hele struktuur gevorm word. (B en C) Die oppervlakvoorstelling van die apolipoproteïen en die hele ringstruktuur, wat die sykettingsuurstof van L-Phe217 in blou en L-Tyr223 in rooi onderskeidelik uitlig. Die L-subeenheid is oranje; die M- en H-subeenhede is nie gekleur nie. (D en E) Apolipoproteïen (D) en hele (E) RC QB-plekke [kleur onderskeidelik volgens (A)] en Thermophilus thermophilus PSII (groen, blou met plastiekkinon; PDB ID: 3WU2) Rig (58).
Onverwags, alhoewel verskeie strukture van QB-gebrekkige RC's sonder LH1 beskikbaar is, is die konformasieveranderinge wat in hierdie studie waargeneem is, nog nie voorheen gerapporteer nie. Dit sluit in die QB-uitputtingstruktuur van Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) en Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), wat almal amper dieselfde is as hul algehele QB-struktuur. Noukeurige inspeksie van 3PRC het aan die lig gebring dat LDAO (Laurieldimetielamienoksied) skoonmaakmiddelmolekules by die ingang van die QB-posisie bind, wat herrangskikking in 'n geslote konformasie kan voorkom. Alhoewel LDAO nie by dieselfde posisie in 1EYS of 1OGV ontbind nie, word hierdie RC's met dieselfde skoonmaakmiddel voorberei en kan dus dieselfde effek produseer. Die kristalstruktuur van Rba. Sphaeroides RC, saamgekristalliseer met sitochroom c2 (PDB ID: 1L9B), blyk ook 'n geslote QB-plek te hê. In hierdie geval neem die N-terminale gebied van die RC-M polipeptied (wat met die QB-bindingsplek interaksie het deur die H-binding van die Tyr-residu op die Q-heliks) egter 'n onnatuurlike konformasie aan, en die QB-konformasieverandering word nie verder ondersoek nie (30). Wat gerusstellend is, is dat ons nie hierdie soort vervorming van die M-polipeptied in die RC-LH114-W-struktuur gesien het nie, wat amper dieselfde is as die N-terminale gebied van RC-LH116 RC. Daar moet ook op gelet word dat na die uitwissing van die detergent-gebaseerde LH1-antenna, die apolipoproteïen-RC's in die PDB opgelos is, wat die interne kinoonpoele en lipiede in die gaping tussen die RC en die binneste oppervlak van die omliggende LH1-ring uitgeskakel het (31, 32). RC bly funksioneel omdat dit alle kofaktore behou, behalwe vir die ontbindbare QB-kinoon, wat minder stabiel is en dikwels tydens die voorbereidingsproses verlore gaan (33). Daarbenewens is dit bekend dat die verwydering van LH1 en natuurlike sikliese lipiede uit RC 'n impak op funksies kan hê, soos die verkorte lewensduur van die lading-geskeide P+QB-toestand (31, 34, 35). Daarom spekuleer ons dat die bestaan ​​van die plaaslike LH1-ring rondom die RC die "geslote" QB-plek kan handhaaf, waardeur die plaaslike omgewing naby die QB bewaar word.
Alhoewel apolipoproteïen (sonder QB-kinoon) en die volledige struktuur slegs twee momentopnames van die omset van die QB-plek verteenwoordig, eerder as 'n reeks gebeurtenisse, is daar aanduidings dat die binding gereguleer kan word om herbinding deur hidrokinoon te voorkom om substraatinhibisie te inhibeer. Die interaksie van kinolol en kinoon naby die QB-plek van apolipoproteïen kan anders wees, wat lei tot die verwerping daarvan deur RC. Daar word al lank voorgestel dat konformasieveranderinge 'n rol speel in die binding en reduksie van kinone. Die vermoë van bevrore RC's om kinone na donker aanpassing te verminder, word benadeel (36); X-straalkristallografie toon dat hierdie skade te wyte is aan QB-kinone wat vasgevang is in 'n "distale" konformasie ongeveer 4.5 Å vanaf die aktiewe proksimale posisie (26, 37). Ons stel voor dat hierdie distale bindingskonformasie 'n momentopname is van die tussentoestand tussen apolipoproteïen en die volledige ringstruktuur, wat volg op die aanvanklike interaksie met kinoon en die opening van die QB-plek.
Die tipe II RC wat in die PSII-kompleks van sekere fototrofiese bakterieë en sianobakterieë, alge en plante voorkom, het strukturele en funksionele behoud (38). Die strukturele belyning wat in Figuur 6 (D en E) getoon word, beklemtoon die ooreenkoms tussen PSII RC's en die QB-plek van die bakteriese RC-kompleks. Hierdie vergelyking is lank reeds 'n model vir die bestudering van die nou verwante stelsels van kinoonbinding en -reduksie. Vorige publikasies het voorgestel dat konformasieveranderinge gepaard gaan met PSII-reduksie van kinone (39, 40). Daarom, as die evolusionêre behoud van RC in ag geneem word, kan hierdie voorheen onwaargenome bindingsmeganisme ook van toepassing wees op die QB-plek van PSII RC in suurstofryke fototrofiese plante.
Rps ΔpufW (ongemerkte pufW-delesie) en PufW-His (C-terminale 10x His-gemerkte proteïen-W uitgedruk vanaf die natuurlike pufW-lokus) stamme. palustris CGA009 is in ons vorige werk (16) beskryf. Hierdie stamme en die isogeniese wildetipe-ouer is uit die vrieskas herwin deur 'n klein aantal selle op PYE (elk 5 g liter -1) (gestoor in LB by -80 °C, wat 50% (g/v) gliserol bevat) proteïen, gisekstrak en suksinaat) agar [1.5% (g/v)] plaat te streep. Die plaat is oornag in die donker by kamertemperatuur onder anaërobiese toestande geïnkubeer, en toe verlig met wit lig (~50 μmolm-2 s-1) verskaf deur OSRAM 116-W halogeengloeilampe (RS Components, VK) vir 3 tot 5 dae totdat 'n enkele kolonie verskyn het. 'n Enkele kolonie is gebruik om 10 ml M22+ medium (41) aangevul met 0.1% (g/v) kasaminosure (hierna verwys as M22) te inokuleer. Die kultuur is onder lae suurstoftoestande in die donker by 34°C gekweek met skudding teen 180 rpm vir 48 uur, en daarna is 70 ml van die kultuur onder dieselfde toestande vir 24 uur geïnokuleer. 'n Semi-aërobiese kultuur met 'n volume van 1 ml word gebruik om 30 ml M22 medium in 'n 30 ml universele skroefdop deursigtige glasbottel te inokuleer en vir 48 uur met roering (~50μmolm-2 s-1) bestraal deur 'n steriele magnetiese roerstaaf. Daarna is 30 ml van die kultuur onder dieselfde toestande geïnokuleer met ongeveer 1 liter kultuur, wat toe gebruik is om ongeveer 9 liter kultuur, verlig teen ~200 μmolm-2 s-1 vir 72 uur, te inokuleer. Die selle is geoes deur sentrifugering by 7132 RCF vir 30 minute, hersuspendeer in ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0), en gestoor by -20°C tot benodig.
Na ontdooiing, voeg 'n paar kristalle van deoksiribonuklease I (Merck, VK), lisosiem (Merck, VK) en twee Roche holoënsiemprotease-inhibeerder tablette (Merck, VK) by die hersuspendeer selle. In 'n 20 000 psi Franse druksel (Aminco, VSA) is die selle 8 tot 12 keer ontwrig. Nadat ongebroke selle en onoplosbare puin verwyder is deur sentrifugering teen 18 500 RCF vir 15 minute by 4°C, is die membraan uit die gepigmenteerde lisaat gepresipiteer deur sentrifugering teen 113 000 RCF vir 2 uur by 43 000°C. Gooi die oplosbare fraksie weg en hersuspendeer die gekleurde membraan in 100 tot 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) en homogeniseer totdat daar geen sigbare aggregate is nie. Die gesuspendeerde membraan is vir 1 uur in die donker by 4°C geïnkubeer in 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, VSA) wat 2% (w/v) β-DDM bevat, met sagte roering. Daarna is dit by 70°C gesentrifugeer om 150 000 RCF by 4°C vir 1 uur op te los om oorblywende onoplosbare stowwe te verwyder.
Die oplosbare membraan van die ΔpufW-stam is op 'n 50 ml DEAE Sepharose-ioonuitruilkolom met drie kolomvolumes (CV) bindingsbuffer [20 mM tris-HCl (pH 8.0) wat 0.03% (w/v) β-DDM bevat] aangebring. Was die kolom met twee CV-bindingsbuffers, en was dan die kolom met twee bindingsbuffers wat 50 mM NaCl bevat. Die RC-LH116-kompleks is met 'n lineêre gradiënt van 150 tot 300 mM NaCl (in bindingsbuffer) op 1.75 CV geëlueer, en die oorblywende bindingskompleks is met 'n bindingsbuffer wat 300 mM NaCl op 0.5 CV geëlueer. Versamel die absorpsiespektrum tussen 250 en 1000 nm, hou die fraksie met 'n absorpsieverhouding (A880/A280) groter as 1 by 880 tot 280 nm, verdun dit twee keer in die bindingsbuffer en gebruik dieselfde prosedure weer op die DEAE-kolom tydens suiwering. Verdun die fraksies met A880/A280-verhoudings hoër as 1.7 en A880/A805-verhoudings hoër as 3.0, voer die derde rondte ioonuitruiling uit en behou fraksies met A880/A280-verhoudings hoër as 2.2 en A880/A805-verhoudings hoër as 5.0. Die gedeeltelik gesuiwerde kompleks is tot ~2 ml gekonsentreer in 'n Amicon 100,000 molekulêre gewigsafsnypunt (MWCO) sentrifugale filter (Merck, VK), en gelaai op 'n Superdex 200 16/600 grootte-uitsluitingskolom (GE Healthcare, VSA) wat 200 mM NaCl-buffer bevat, en toe in dieselfde buffer teen 1.5 CV geëlueer. Versamel die absorpsiespektra van die grootte-uitsluitingsfraksie en konsentreer die absorpsiespektra met A880/A280-verhoudings oor 2.4 en A880/A805-verhoudings oor 5.8 tot 100 A880, en gebruik dit onmiddellik vir krio-TEM-roostervoorbereiding of berging. Hou by -80°C tot benodig.
Die oplosbare membraan van die PufW-His-stam is op 'n 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose-kolom (20 mM tris-HCl (pH 8.0) wat 200 mM NaCl en 0.03% (g/g) bevat) in IMAC-buffer (GE Healthcare) aangebring. (v) β-DDM]. Die kolom is met vyf CV's IMAC-buffer gewas, en toe met vyf CV's IMAC-buffer wat 10 mM histidien bevat. Die kernkompleks is met vyf IMAC-buffers wat 100 mM histidien bevat, uit die kolom geëlueer. Die fraksie wat die RC-LH114-W-kompleks bevat, word tot ~10 ml gekonsentreer in 'n geroerde tenk toegerus met 'n Amicon 100,000 MWCO-filter (Merck, VK), 20 keer verdun met bindingsbuffer, en dan by 25 ml gevoeg. In die DEAE Sepharose-kolom word vier CV's wat aan die buffer gebind is, vooraf gebruik. Was die kolom met vier CV-bindingsbuffers, elueer dan die kompleks op agt CV's op 'n lineêre gradiënt van 0 tot 100 mM NaCl (in bindingsbuffer), en die oorblywende vier CV's wat 100 mM bindingsbuffer bevat. Die oorblywende komplekse wat op die natriumchloried gekombineer is met die A880/A280-verhouding hoër as 2.4 en die A880/A805-verhouding hoër as 4.6 fraksies is tot ~2 ml in 'n Amicon 100 000 MWCO sentrifugale filter gekonsentreer en vooraf met 1.5 CV IMAC gevul. Buffer-geëquilibreerde Superdex 200 16/600 grootte-uitsluitingskolom, en dan in dieselfde buffer oor 1.5 CV geëlueer. Versamel die absorpsiespektra van die grootte-uitsluitingsfraksies en konsentreer die absorpsiespektra met A880/A280-verhoudings oor 2.1 en A880/A805-verhoudings oor 4.6 tot 100 A880, wat onmiddellik gebruik word vir die voorbereiding van die gevriesde TEM-rooster of by -80°C gestoor word tot nodig.
'n Leica EM GP-onderdompelingsvrieskas is gebruik om laetemperatuur-TEM-roosters voor te berei. Die kompleks is verdun in IMAC-buffer tot A880 van 50, en toe is 5 μl op 'n nuut gloei-ontlaaide QUANTIFOIL 1.2/1.3 koolstofbedekte kopermaas (Agar Scientific, VK) gelaai. Inkubeer die rooster by 20°C en 60% relatiewe humiditeit vir 30 s, droog dit dan vir 3 s af en blus dit dan in vloeibare etaan by -176°C.
Die data van die RC-LH114-W-kompleks is op die eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) opgeneem met 'n Titan Krios-mikroskoop, wat werk teen 'n versnellingspanning van 300 kV, met 'n nominale vergroting van 130 000 × en 'n energie van 20 eV. 'n Gatan 968 GIF Quantum met K2-piekdetektor is gebruik om beelde in telmodus op te neem om data in te samel. Die gekalibreerde pixelgrootte is 1.048 Å, en die dosistempo is 3.83 e-Å-2s-1. Die film is in 11 sekondes versamel en in 40 dele verdeel. Gebruik die koolstofbedekte area om die mikroskoop te herfokus, en versamel dan drie films per gaatjie. In totaal is 3130 films versamel, met defokuswaardes tussen -1 en -3 μm.
Die data vir die RC-LH116-kompleks is met dieselfde mikroskoop by die Asterbury Biostructure Laboratory (Universiteit van Leeds, VK) versamel. Die data is in telmodus met 'n vergroting van 130 k versamel, en die pixelgrootte is gekalibreer tot 1.065 Å met 'n dosis van 4.6 e-Å-2s-1. Die film is in 12 sekondes opgeneem en in 48 dele verdeel. In totaal is 3359 films versamel, met defokuswaardes tussen -1 en -3μm.
Alle dataverwerking word in die Relion 3.0-pyplyn (42) uitgevoer. Gebruik Motioncorr 2 (43) om die straalbeweging deur dosisgewig te korrigeer, en gebruik dan CTFFIND 4.1 (44) om die CTF (kontrasoordragfunksie) parameter te bepaal. Tipiese fotomikrograwe na hierdie aanvanklike verwerkingstadiums word in Figuur 2. S16 getoon. Die outomatiese seleksiesjabloon word gegenereer deur ongeveer 250 pixels van 1000 deeltjies in 'n 250-pixel raam en geen verwysing tweedimensionele (2D) klassifikasie handmatig te selekteer, waardeur die klassifikasies wat aan monsterkontaminasie voldoen of geen onderskeibare eienskappe het nie, verwerp word. Daarna is outomatiese seleksie op al die mikrofoto's uitgevoer, en die RC-LH114-W was 849 359 deeltjies, en die RC-LH116-kompleks was 476 547 deeltjies. Alle geselekteerde deeltjies het twee rondes van nie-verwysings 2D-klassifikasie ondergaan, en na elke lopie word die deeltjies wat aan die koolstofarea, monsterkontaminasie, geen ooglopende kenmerke of sterk oorvleuelende deeltjies voldoen nie, verwerp, wat lei tot 772 033 (90,9%) en 359 678 (75,5%). Deeltjies word gebruik vir 3D-klassifikasie van onderskeidelik RC-LH114-W en RC-LH116. Die aanvanklike 3D-verwysingsmodel is gegenereer met behulp van die stogastiese gradiëntafdalingsmetode. Deur die aanvanklike model as 'n verwysing te gebruik, word die geselekteerde deeltjies in vier kategorieë in 3D geklassifiseer. Deur die model in hierdie kategorie as 'n verwysing te gebruik, voer 3D-verfyning uit op die deeltjies in die grootste kategorie, gebruik dan die aanvanklike 15 Å laagdeurlaatfilter om die oplosmiddelarea te bedek, voeg 6 pixels sagte rande by, en verwerk die pixels na om die Gatan K2-piekmodulasie-oordragfunksie van die boonste detektor reg te stel. Vir die RC-LH114-W datastel is hierdie aanvanklike model gewysig deur die sterk digtheid aan die kante van die masker te verwyder (ontkoppel van die kernkompleksdigtheid in UCSF Chimera). Die gevolglike modelle (die resolusies van RC-LH114-W en RC-LH116 is onderskeidelik 3.91 en 4.16 Å) word as verwysing vir die tweede ronde van 3D-klassifikasie gebruik. Die deeltjies wat gebruik word, word in die aanvanklike 3D-klas gegroepeer en bevat nie sterk korrelasie met die omgewing nie. Oorvleueling of gebrek aan ooglopende strukturele kenmerke. Na die tweede ronde van 3D-klassifikasie is die kategorie met die hoogste resolusie gekies [Vir RC-LH114-W is een kategorie 377 703 deeltjies (44.5%), vir RC-LH116 is daar twee kategorieë, wat altesaam 260 752 deeltjies (54.7%) beloop, waar hulle slegs dieselfde is wanneer hulle na die aanvanklike rotasie in lyn gebring word met 'n klein verskil]. Die geselekteerde deeltjies word weer in 'n 400-pixel-boks onttrek en deur 3D-verfyning verfyn. Die oplosmiddelmasker word gegenereer met behulp van die aanvanklike 15Å laagdeurlaatfilter, 3-pixel-kaartuitbreiding en 3-pixel sagte masker. Deur gebruik te maak van per-deeltjie CTF-verfyning, per-deeltjie-bewegingskorreksie en die tweede ronde van per-deeltjie CTF-verfyning, word 3D-verfyning, oplosmiddelmaskering en naverwerking na elke stap uitgevoer om die resulterende tekstuur verder te verfyn. Deur die FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) afsnywaarde van 0.143 te gebruik, is die resolusies van die finale modelle van RC-LH114-W en RC-LH116 onderskeidelik 2.65 en 2.80 Å. Die FSC-kurwe van die finale model word in Figuur 2 getoon. S17.
Alle proteïenvolgordes word afgelaai vanaf UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Proteïen-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) is gebruik om 'n homologiemodel van RC te konstrueer, wat die proteïenvolgordes van RC-L, RC-M en RC-H en die kristalstruktuur van Rba bevat. sphaeroides RC is as 'n sjabloon gebruik (PDB ID: 5LSE) (46). Gebruik die "fit map"-instrument in UCSF Chimera om die gegenereerde model by die kaart te pas (47), verbeter die proteïenstruktuur, en kofaktor [4×BChl a (monomeerbiblioteekresidunaam = BCL), 2×BPh a (BPH), een of twee soorte UQ10 (U10), een nie-heem-yster (Fe) en een 3,4-dihidroheksakarbonielcholien (QAK)] gebruik Coot (48) om by te voeg. Aangesien QAK nie in die monomeerbiblioteek beskikbaar is nie, is dit geparameteriseer met behulp van die eLBOW-instrument in PHENIX (49).
Volgende is die LH1-subeenheid gekonstrueer. Aanvanklik is die outomatiese konstruksie-instrument in PHENIX (49) gebruik om outomaties 'n deel van die LH1-volgorde te konstrueer deur die kaart en die LH1-α en LH1-β proteïenvolgordes as invoer te gebruik. Kies die mees volledige LH1-subeenheid, onttrek dit en laai dit in Coot, voeg die ontbrekende volgorde handmatig by, en verfyn die hele struktuur handmatig voordat twee BCls a (BCL) en 'n spirilloxantien (CRT) bygevoeg word [volgens die relevante Rps Die digtheid van die LH1-kompleks en die bekende karotenoïedinhoud. Spesies (17)]. Kopieer die volledige LH1-subeenheid, en gebruik die UCSF Chimera "Docking Map Tool" om die aangrensende nie-modelarea van LH1-digtheid in te dok, en verfyn dit dan in Coot; herhaal die proses totdat alle LH1-subeenhede gemodelleer is. Vir die RC-LH114-W-struktuur, deur die ongeallokeerde digtheid in die Coot te onttrek, word die proteïen gesegmenteer van die oorblywende nie-proteïenkomponente in die USCF Chimera-kaart en die Autobuild-instrument word gebruik om die aanvanklike model en die oorblywende subeenhede (proteïen-W) Modellering te vestig. In PHENIX (49). Voeg enige ontbrekende rye by die resulterende model in Coot (48), en verfyn dan die hele subeenheid handmatig. Die oorblywende ongeallokeerde digtheid pas by die kombinasie van lipiede (PDB-monomeerbiblioteek-ID van CDL = CDL, POPC = 6PL en POPG = PGT), β-DDM-detergent (LMT) en UQ10-molekules (U10). Gebruik PHENIX-optimering (49) en handmatige optimalisering in Coot (48) om die volledige aanvanklike model te vervolmaak totdat die modelstatistieke en die visuele kwaliteit van die passing nie verder verbeter kan word nie. Laastens, gebruik LocScale (50) om die plaaslike kaart te verskerp, en voer dan verskeie ander siklusse van modellering van die ongeallokeerde digtheid en outomatiese en handmatige optimalisering uit.
Die onderskeie peptiede, kofaktore en ander lipiede en kinone wat binne hul onderskeie digthede gekoppel is, word in Figure 1 en 2, S18 tot S23, getoon. Die statistiese inligting van die finale model word in Tabel S1 getoon.
Tensy anders vermeld, is die UV/Vis/NIR-absorpsiespektra versamel op 'n Cary60-spektrofotometer (Agilent, VSA) met intervalle van 1 nm van 250 nm tot 1000 nm en 'n integrasietyd van 0.1 s.
Verdun die monster in 'n kwarts-kuvet met 'n 2 mm-pad na A880 van 1, en versamel die absorpsiespektrum tussen 400 en 1000 nm. Die sirkelvormige dichroïese spektra is versamel op 'n Jasco 810 spektropolarimeter (Jasco, Japan) met 1 nm-intervalle tussen 400 nm en 950 nm teen 'n skandeerspoed van 20 nm min-1.
Die molêre uitsterwingskoëffisiënt word bepaal deur die kernkompleks te verdun tot 'n A880 van ongeveer 50. Verdun die 10μl volume in 990μl bindingsbuffer of metanol, en versamel die absorpsiespektrum onmiddellik om BChl-afbraak te minimaliseer. Die BChl-inhoud van elke metanolmonster is bereken deur die uitsterwingskoëffisiënt by 771 nm van 54.8 mM-1 cm-1, en die uitsterwingskoëffisiënt is bepaal (51). Deel die gemete BChl-konsentrasie deur 32 (RC-LH114-W) of 36 (RC-LH116) om die kernkomplekskonsentrasie te bepaal, wat dan gebruik word om die absorpsiespektrum van dieselfde monster wat in die buffer parallel versamel is, te bepaal. Drie herhaalde metings is vir elke monster geneem, en die gemiddelde absorpsie van die BChl Qy-maksimum is vir berekening gebruik. Die uitsterwingskoëffisiënt van RC-LH114-W gemeet teen 878 nm is 3280 ± 140 mM-1 cm-1, terwyl die uitsterwingskoëffisiënt van RC-LH116 gemeet teen 880 nm 3800 ± 30 mM-1 cm-1 is.
UQ10 is gekwantifiseer volgens die metode in (52). Kortliks, omgekeerde fase HPLC (RP-HPLC) is uitgevoer met behulp van die Agilent 1200 HPLC-stelsel. Los ongeveer 0.02 nmol RC-LH116 of RC-LH114-W op in 50μl 50:50 metanol:chloroform wat 0.02% (g/v) ysterchloried bevat, en spuit die vooraf-geëquilibreerde Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm Oplossing in 1 ml-1 min-1 by 40°C in HPLC-oplosmiddel (80:20 metanol:2-propanol) op 'n ×25 cm kolom. Voer isokratiese eluering uit in 'n HPLC-oplosmiddel om absorbansie te monitor by 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoïede) en 780 nm (BChl) vir 1 uur. Die piek in die 275 nm chromatogram na 25.5 minute is geïntegreer, wat geen ander opspoorbare verbindings bevat het nie. Die geïntegreerde area word gebruik om die molêre hoeveelheid UQ10 wat onttrek is, te bereken met verwysing na die kalibrasiekurwe wat bereken is uit die inspuiting van suiwer standaarde van 0 tot 5.8 nmol (Figuur S14). Elke monster is in drie replikate geanaliseer, en die gerapporteerde fout stem ooreen met die SD van die gemiddelde.
'n Oplossing wat die RC-LH1-kompleks met 'n maksimum Qy-absorpsie van 0.1 bevat, is voorberei met 30 μM gereduseerde perdehart-sitochroom c2 (Merck, VK) en 0 tot 50 μMUQ2 (Merck, VK). Drie 1-ml monsters is by elke UQ2-konsentrasie voorberei en oornag in die donker by 4°C geïnkubeer om volledige aanpassing aan die donker voor meting te verseker. Die oplossing is in 'n OLIS RSM1000 modulêre spektrofotometer gelaai, toegerus met 'n 300 nm vlam/500-lynrooster, 1.24 mm inlaat, 0.12 mm middel en 0.6 mm uitlaatgleuwe. 'n 600 nm lange deurlaatfilter word by die ingang van die monsterfotobuis en die verwysingsfotomultiplikatorbuis geplaas om opwekkingslig uit te sluit. Die absorpsie is by 550 nm gemonitor met 'n integrasietyd van 0.15 s. Die opwekkingslig word uitgestraal deur die 880 nm M880F2 LED (Liguitstralende Diode) (Thorlabs Bpk., VK) deur 'n veseloptiese kabel teen 90% intensiteit deur 'n DC2200-beheerder (Thorlabs Bpk., VK) en word teen 'n hoek van 90° na die ligbron uitgestraal. Die meetstraal is teenoor die spieël gerig om enige lig terug te stuur wat nie aanvanklik deur die monster geabsorbeer is nie. Monitor die absorbansie 10 s voor die verligting van 50 s. Daarna is die absorbansie verder vir 60 s in die donker gemonitor om die mate waarin kinolol spontaan sitochroom c23+ verminder, te bepaal (sien Figuur S8 vir rou data).
Die data is verwerk deur 'n lineêre aanvanklike tempo binne 0.5 tot 10 s (afhangende van die UQ2-konsentrasie) aan te pas en die tempo's van al drie monsters by elke UQ2-konsentrasie te gemiddeld. Die RC-LH1-konsentrasie wat deur die onderskeie uitsterwingskoëffisiënt bereken is, is gebruik om die tempo om te skakel na die katalitiese doeltreffendheid, wat in Origin Pro 2019 (OriginLab, VSA) geplot is, en by die Michaelis-Menten-model aangepas is om die skynbare Km- en Kcat-waardes te bepaal.
Vir oorgangsabsorpsiemetings is die RC-LH1-monster verdun tot ~2μM in IMAC-buffer wat 50 mM natriumaskorbaat (Merck, VSA) en 0.4 mM Terbutien (Merck, VSA) bevat. Askorbiensuur word as 'n opofferende elektronskenker gebruik, en tert-butaklofen word as 'n QB-inhibeerder gebruik om te verseker dat die hoof RC-skenker gereduseer (dit wil sê nie foto-oksideer nie) bly dwarsdeur die meetproses. Ongeveer 3 ml monster word by 'n pasgemaakte roterende sel (ongeveer 0.1 m in deursnee, 350 RPM) met 'n 2 mm optiese padlengte gevoeg om te verseker dat die monster in die laserpad genoeg tyd het vir donker aanpassing tussen opwekkingspulse. Gebruik ~100-fs laserpulse om die Ti:Sapphire-laserstelsel (Spectra Physics, VSA) te versterk om die monster by 880 nm teen 'n herhalingstempo van 1 kHz (20 nJ vir NIR of 100 nJ vir Vis) op te wek. Voordat data ingesamel word, stel die monster vir ongeveer 30 minute aan opwekkingslig bloot. Blootstelling sal QA-inaktivering veroorsaak (moontlik QA een of twee keer verminder). Let egter daarop dat hierdie proses omkeerbaar is, want na 'n lang tydperk van donkeraanpassing sal RC stadig terugkeer na QA-aktiwiteit. 'n Helios-spektrometer (Ultrafast Systems, VSA) is gebruik om oorgangsspektra te meet met 'n vertragingstyd van -10 tot 7000 ps. Gebruik Surface Xplorer-sagteware (Ultrafast Systems, VSA) om die datastelle te ontgroepeer, dan saam te voeg en te standaardiseer. Gebruik die CarpetView-sagtewarepakket (Light Conversion Ltd., Litaue) om die gekombineerde datastel te gebruik om differensiële spektra wat verband hou met verval te verkry, of gebruik 'n funksie wat veelvuldige eksponente met die instrumentrespons konvolveer om by die enkelgolflengte-spektrale evolusie in Origin (OriginLab, VSA) te pas.
Soos hierbo genoem (53), is 'n fotosintetiese film wat die LH1-kompleks bevat, sonder beide RC- en perifere LH2-antenna, voorberei. Die membraan is verdun in 20 mM tris (pH 8.0) en toe in 'n kwarts-kuvet met 'n 2 mm optiese pad gelaai. 'n 30nJ-laserpuls is gebruik om die monster by 540 nm op te wek met 'n vertragingstyd van -10 tot 7000 ps. Verwerk die datastel soos beskryf vir die Rps. pal-monster.
Die membraan is gepelleteer deur sentrifugering teen 150 000 RCF vir 2 uur by 4°C, en daarna is die absorbansie daarvan by 880 nm hersuspendeer in 20 mM tris-HCl (pH 8.0) en 200 mM NaCl. Los die membraan op deur stadig 2% (g/v) β-DDM vir 1 uur in die donker by 4°C in te roer. Die monster is verdun in 100 mM triëtilammoniumkarbonaat (pH 8.0) (TEAB; Merck, VK) tot 'n proteïenkonsentrasie van 2.5 mg ml-1 (Bio-Rad-analise). Verdere verwerking is uitgevoer vanaf die voorheen gepubliseerde metode (54), beginnende met die verdunning van 50 μg proteïen in 'n totaal van 50 μl TEAB wat 1% (g/v) natriumlauraat bevat (Merck, VK). Na sonikasie vir 60 s, is dit gereduseer met 5 mM tris(2-karboksietiel)fosfien (Merck, VK) by 37°C vir 30 minute. Vir S-alkilering, inkubeer die monster met 10 mM metiel S-metieltiometaansulfonaat (Merck, VK) en voeg dit by vanaf 'n 200 mM isopropanol-voorraadoplossing vir 10 minute by kamertemperatuur. Proteolitiese vertering is uitgevoer deur 2 μg tripsin/endoproteïnase Lys-C-mengsel (Promega VK) by te voeg en vir 3 uur by 37°C te inkubeer. Die lauraat-surfaktant is geëkstraheer deur 50 μl etielasetaat en 10 μl 10% (v/v) LC-graad trifluoroasynsuur (TFA; Thermo Fisher Scientific, VK) by te voeg en vir 60 s te vortex. Die faseskeiding is bevorder deur sentrifugering by 15 700 RCF vir 5 minute. Volgens die vervaardiger se protokol is 'n C18-spinkolom (Thermo Fisher Scientific, VK) gebruik om die onderste fase wat die peptied bevat, versigtig te aspireer en te ontsout. Na droging deur vakuumsentrifugering is die monster opgelos in 0.5% TFA en 3% asetonitriel, en 500 ng is geanaliseer deur nanovloei RP-chromatografie gekoppel aan massaspektrometrie met behulp van die stelselparameters wat voorheen uiteengesit is.
Gebruik MaxQuant v.1.5.3.30 (56) vir proteïenidentifikasie en kwantifisering om te soek na die Rps. palustris proteoomdatabasis (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Die massaspektrometrie proteomika-data is in die ProteomeXchange Alliance gedeponeer deur die PRIDE-vennootbewaarplek (http://proteomecentral.proteomexchange.org) onder die datastel-identifiseerder PXD020402.
Vir analise deur RPLC gekoppel aan elektrosproei-ionisasiemassaspektrometrie, is die RC-LH1-kompleks voorberei uit wildetipe Rps. Deur die voorheen gepubliseerde metode (16) te gebruik, was die proteïenkonsentrasie wat in palustris-selle geproduseer is 2 mg ml-1 in 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl en 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad-analise)) DDM. Volgens die vervaardiger se protokol, gebruik 'n 2D-suiweringstel (GE Healthcare, VSA) om 10 μg proteïen deur die presipitasiemetode te ekstraheer, en los die presipitaat op in 20 μl 60% (v/v) mieresuur (FA), 20% (v/v) asetonitriel en 20% (v/v) water. Vyf mikroliter is geanaliseer deur RPLC (Dionex RSLC) gekoppel aan massaspektrometrie (Maxis UHR-TOF, Bruker). Gebruik 'n MabPac 1.2×100 mm kolom (Thermo Fisher Scientific, VK) vir skeiding by 60°C en 100μlmin-1, met 'n gradiënt van 85% (v/v) oplosmiddel A [0.1% (v/v) VS en 0.02% (V/v) TVS waterige oplossing] tot 85% (v/v) oplosmiddel B [0.1% (v/v) VS en 0.02% (v/v) in 90% (v/v) asetonitriel TVS]. Deur gebruik te maak van 'n standaard elektrosproei-ionisasiebron en standaardparameters vir meer as 60 minute, verkry die massaspektrometer 100 tot 2750 m/z (massa-tot-lading-verhouding). Met behulp van die ExPASy bioinformatika-hulpbronportaal FindPept-instrument (https://web.expasy.org/findpept/), karteer die massaspektrum na die subeenhede van die kompleks.
Die selle is vir 72 uur gekweek onder 100 ml NF-lae (10μMm-2 s-1), medium (30μMm-2 s-1) of hoë (300μMm-2 s-1) lig. M22-medium (M22-medium waarin ammoniumsulfaat weggelaat is en natriumsuksinaat vervang is met natriumasetaat) in 'n 100 ml skroefdopbottel (23). In vyf 30-s siklusse is 0.1 mikron glaskrale teen 'n volumeverhouding van 1:1 gekraal om die selle te liseer en vir 5 minute op ys verkoel. Die onoplosbare materiaal, ongebroke selle en glaskrale is verwyder deur sentrifugering teen 16 000 RCF vir 10 minute in 'n tafelblad-mikrosentrifuge. Die membraan is vir 10 uur in 'n Ti 70.1 rotor met 100 000 RCF in 20 mM tris-HCl (pH 8.0) met 'n 40/15% (g/g) sukrosegradiënt geskei.
Soos beskryf in ons vorige werk, immunodeteksie van die His-merker op PufW (16). Kortliks, die gesuiwerde kernkompleks (11.8 nM) of die membraan wat dieselfde konsentrasie RC bevat (bepaal deur oksidasie, aftrekking van die verminderde verskilspektrum en aanpassing van die lading op die gekleurde gel) in 2x SDS-laaibuffer (Merck, VK) is twee keer verdun. Die proteïene is geskei op 'n replika 12% bis-tris NuPage-gel (Thermo Fisher Scientific, VK). 'n Gel is gekleur met Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, VK) om die RC-L-subeenheid te laai en te visualiseer. Die proteïen op die tweede gel is oorgedra na 'n metanol-geaktiveerde polivinilideenfluoried (PVDF) membraan (Thermo Fisher Scientific, VK) vir immuno-analise. Die PVDF-membraan is geblokkeer in 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 en 5% (w/v) afgeroomde melkpoeier, en toe geïnkubeer met die anti-His primêre teenliggaam (in Verdun die teenliggaambuffer [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl en 0.05% (v/v) Tween-20] in 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, VSA) vir 4 uur. Nadat die membraan 3 keer vir 5 minute in teenliggaambuffer gewas is, is dit gekombineer met peperwortelperoksidase (Sigma-Aldrich, VK) anti-muis sekondêre teenliggaam (verdun 1:10 000 in teenliggaambuffer). Inkubeer om deteksie toe te laat (5 minute na 3 wasse in teenliggaambuffer) met behulp van WESTAR ETA C 2.0 chemiluminessensie-substraat (Cyanagen, Italië) en Amersham Imager 600 (GE Healthcare, VK).
Deur die intensiteitsverspreiding van elke gekleurde gel of immunoassaybaan te teken, die area onder die piek te integreer en die intensiteitsverhouding van RC-L (gekleurde gel) en Proteïen-W (immunoassay) te bereken, in ImageJ (57) verwerk die beeld. Hierdie verhoudings is omgeskakel na molêre verhoudings deur aan te neem dat die verhouding van RC-L tot proteïen-W in die suiwer RC-LH114-W monster 1:1 was en die hele datastel dienooreenkomstig te normaliseer.
Vir aanvullende materiaal vir hierdie artikel, sien asseblief http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Hierdie is 'n ooptoegangartikel wat versprei word onder die bepalings van die Creative Commons Attribution License. Die artikel laat onbeperkte gebruik, verspreiding en reproduksie in enige medium toe onder die voorwaarde dat die oorspronklike werk behoorlik aangehaal word.
Let wel: Ons vra jou slegs om jou e-posadres te verskaf sodat die persoon wat jy aanbeveel vir die bladsy weet dat jy wil hê hulle moet die e-pos sien en dat dit nie strooipos is nie. Ons sal geen e-posadresse vasvang nie.
Hierdie vraag word gebruik om te toets of jy 'n besoeker is en om outomatiese strooipos-indiening te voorkom.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Die hoeresolusiestruktuur van die ligval 1-kompleks in die reaksiesentrum bied nuwe insigte in die kinondinamika.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Die hoeresolusiestruktuur van die ligval 1-kompleks in die reaksiesentrum bied nuwe insigte in die kinondinamika.
©2021 American Association for the Advancement of Science. alle regte voorbehou. AAAS is 'n vennoot van HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.