Huidige *Huidige adres: Keulen 50931, Duitsland, Keulen Uitnemendheidskluster Navorsing oor Sellulêre Stresrespons in Verouderingsverwante Siektes (CECAD).
Die neurodegenerasie van mitochondriale siektes word as onomkeerbaar beskou omdat die metaboliese plastisiteit van neurone beperk is, maar die effek van mitochondriale disfunksie op die sel-outonomie van neuronale metabolisme in die liggaam word swak verstaan. Hier stel ons die selspesifieke proteoom van Purkinje-neurone met progressiewe OXPHOS-tekort bekend wat veroorsaak word deur ontwrigte mitochondriale fusiedinamika. Ons het gevind dat mitochondriale disfunksie 'n diepgaande verandering in die veld van proteomika veroorsaak het, wat uiteindelik gelei het tot die opeenvolgende aktivering van presiese metaboliese programme voor seldood. Onverwags het ons die duidelike induksie van piruvaatkarboksilase (PCx) en ander anti-verouderingsensieme bepaal wat die tussenprodukte van die TCA-siklus aanvul. Inhibisie van PCx het oksidatiewe stres en neurodegenerasie vererger, wat aandui dat aterosklerose 'n beskermende effek het in neurone wat OXPHOS kortkom. Die herstel van mitochondriale fusie in terminaal gedegenereerde neurone keer hierdie metaboliese eienskappe heeltemal om, waardeur seldood voorkom word. Ons bevindinge identifiseer voorheen onbekende weë wat veerkragtigheid teen mitochondriale disfunksie verleen en toon dat neurodegenerasie selfs in die laat stadiums van die siekte omgekeer kan word.
Die sentrale rol van mitochondria in die handhawing van neuronale energiemetabolisme word beklemtoon deur die uitgebreide neurologiese simptome wat verband hou met menslike mitochondriale siektes. Die meeste van hierdie siektes word veroorsaak deur geenmutasies wat mitochondriale geenuitdrukking reguleer (1, 2) of geenvernietiging wat verband hou met mitochondriale dinamika, wat indirek die stabiliteit van mitochondriale DNS (mtDNS) beïnvloed (3, 4). Werk in diermodelle het getoon dat in reaksie op mitochondriale disfunksie in omliggende weefsels, konserwatiewe metaboliese weë (5-7) geaktiveer kan word, wat belangrike inligting verskaf vir 'n diepgaande begrip van die patogenese van hierdie komplekse siektes. In skrille teenstelling hiermee is ons begrip van die metaboliese veranderinge van spesifieke seltipes wat veroorsaak word deur die algemene mislukking van brein mitochondriale adenosientrifosfaat (ATP) produksie fundamenteel (8), wat die behoefte beklemtoon om terapeutiese teikens te identifiseer wat gebruik kan word om siektes te voorkom of te voorkom. Voorkoming van neurodegenerasie (9). Die gebrek aan inligting is die feit dat senuweeselle wyd beskou word as baie beperkte metaboliese buigsaamheid in vergelyking met die seltipes van omliggende weefsels (10). Aangesien hierdie selle 'n sentrale rol speel in die koördinering van die toevoer van metaboliete aan neurone om sinaptiese oordrag te bevorder en op beserings en siektetoestande te reageer, is die vermoë om selmetabolisme aan te pas by die uitdagende toestande van breinweefsel byna beperk tot gliaselle (11-14). Boonop belemmer die inherente sellulêre heterogeniteit van breinweefsel grootliks die studie van metaboliese veranderinge wat in spesifieke neuronale subgroepe voorkom. Gevolglik is min bekend oor die presiese sellulêre en metaboliese gevolge van mitochondriale disfunksie in neurone.
Om die metaboliese gevolge van mitochondriale disfunksie te verstaan, het ons Purkinje-neurone (PN's) in verskillende stadiums van neurodegenerasie geïsoleer, wat veroorsaak word deur die vernietiging van mitochondriale buitenste membraanfusie (Mfn2). Alhoewel Mfn2-mutasies in mense geassosieer word met 'n vorm van oorerflike motoriese sensoriese neuropatie bekend as Charcot-Marie-Tooth tipe 2A (15), is die voorwaardelike vernietiging van Mfn2 in muise 'n welbekende induksie van oksidasie fosforilering (OXPHOS) disfunksiemetode. Die verskillende neuronale subtipes (16-19) en die gevolglike neurodegeneratiewe fenotipe word vergesel deur progressiewe neurologiese simptome, soos bewegingsversteurings (18, 19) of serebellêre ataksie (16). Deur 'n kombinasie van etiketvrye kwantitatiewe (LFQ) proteomika, metabolomika, beeldvorming en virologiese metodes te gebruik, toon ons dat progressiewe neurodegenerasie piruvaatkarboksilase (PCx) en ander faktore wat betrokke is by arteriosklerose van PN's in vivo, die uitdrukking van ensieme, sterk induseer. Om die relevansie van hierdie bevinding te verifieer, het ons spesifiek die uitdrukking van PCx in Mfn2-gebrekkige PN'e afgereguleer, en gevind dat hierdie operasie oksidatiewe stres vererger en neurodegenerasie versnel het, wat bewys dat asoospermie seldood en metaboliese aanpasbaarheid verleen. Erge uitdrukking van MFN2 kan die terminale degenerasie PN met ernstige OXPHOS-tekort, massiewe verbruik van mitochondriale DNS en 'n skynbaar gebreekte mitochondriale netwerk heeltemal red, wat verder beklemtoon dat hierdie vorm van neurodegenerasie selfs in die gevorderde stadium van die siekte voor seldood kan herstel.
Om die mitochondria in Mfn2-uitklop-PN'e te visualiseer, het ons 'n muisstam gebruik wat Cre-afhanklike mitochondria toelaat om geel fluorescerende proteïen (YFP) (mtYFP) (20) Cre-uitdrukking te teiken en die mitochondriale morfologie in vivo nagegaan. Ons het gevind dat die vernietiging van die Mfn2-geen in PN'e sou lei tot die geleidelike verdeling van die mitochondriale netwerk (Figuur S1A), en die vroegste verandering is op 3 weke ouderdom gevind. In teenstelling hiermee het die aansienlike degenerasie van die PN-sellaag, soos blyk uit die verlies van Calbindin-immunokleuring, eers op 12 weke ouderdom begin (Figuur 1, A en B). Die tydsverskil tussen die vroegste veranderinge in mitochondriale morfologie en die sigbare aanvang van neuronale dood het ons aangespoor om die metaboliese veranderinge wat deur mitochondriale disfunksie voor seldood veroorsaak word, te ondersoek. Ons het 'n fluoresensie-geaktiveerde selsortering (FACS)-gebaseerde strategie ontwikkel om YFP (YFP+)-uitdrukkende PN (Figuur 1C) te isoleer, en in kontrolemuise (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), hierna verwys as CTRL (Figuur S1B). Die optimalisering van die poortstrategie gebaseer op die relatiewe intensiteit van die YFP-sein stel ons in staat om die YFP+ liggaam (YFPhigh) van PN'e te suiwer van nie-PN'e (YFPneg) (Figuur S1B) of vermeende fluorescerende akson/dendritiese fragmente (YFPlow; Figuur S1D, links), bevestig deur 'n konfokale mikroskoop (Figuur S1D, regs). Om die identiteit van die geklassifiseerde populasie te verifieer, het ons LFQ proteomika en dan hoofkomponentanalise uitgevoer, en gevind dat daar 'n duidelike skeiding tussen YFPhigh- en YFPneg-selle is (Figuur S1C). YFPhigh-selle het 'n netto verryking van bekende PN-merkers getoon (dws Calb1, Pcp2, Grid2 en Itpr3) (21, 22), maar geen verryking van proteïene wat algemeen in neurone of ander seltipes uitgedruk word nie (Figuur 1D)). 'n Vergelyking tussen monsters in geklassifiseerde YFPhigh-selle wat in onafhanklike eksperimente versamel is, het 'n korrelasiekoëffisiënt van > 0.9 getoon, wat goeie reproduceerbaarheid tussen biologiese replikate toon (Figuur S1E). Opsommend het hierdie data ons plan vir akute en spesifieke isolasie van haalbare PN bekragtig. Omdat die L7-cre-drywerstelsel wat gebruik is, mosaïekrekombinasie in die eerste week na geboorte induseer (23), het ons begin om muise van CTRL en voorwaardelike (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) neurone te verwyder. Nadat rekombinasie voltooi is, word dit Mfn2cKO genoem op 4 weke ouderdom. As eindpunt het ons 8 weke oud gekies toe die PN-laag ongeskonde was ten spyte van die ooglopende mitochondriale fragmentasie (Figuur 1B en Figuur S1A). In totaal het ons 'n totaal van 3013 proteïene gekwantifiseer, waarvan ongeveer 22% gebaseer was op MitoCarta 2.0-annotasies gebaseer op die mitochondriale proteoom as mitochondria (Figuur 1E) (Figuur 1E) (24). Die differensiële geenekspressie-analise wat in week 8 uitgevoer is, het getoon dat slegs 10.5% van alle proteïene beduidende veranderinge gehad het (Figuur 1F en Figuur S1F), waarvan 195 proteïene afgereguleer en 120 proteïene opgereguleer is (Figuur 1F). Dit is opmerklik dat die "innoverende padanalise" van hierdie datastel toon dat die differensieel uitgedrukte gene hoofsaaklik tot 'n beperkte stel spesifieke metaboliese bane behoort (Figuur 1G). Interessant genoeg, hoewel die afregulering van bane wat verband hou met OXPHOS en kalsiumseintransduksie die induksie van mitochondriale disfunksie in fusie-gebrekkige PN'e bevestig, word ander kategorieë wat hoofsaaklik aminosuurmetabolisme behels, aansienlik opgereguleer, wat in lyn is met die metabolisme wat in mitochondriale PN'e-disfunksie plaasvind. Herbedrading is konsekwent.
(A) Verteenwoordigende konfokale foto's van serebellêre gedeeltes van CTRL- en Mfn2cKO-muise wat progressiewe verlies van PN'e (calbindin, grys) toon; kerne is teengekleur met DAPI. (B) Kwantifisering van (A) (eenrigting-variansie-analise, ***P<0.001; n = 4 tot 6 sirkels van drie muise). (C) Eksperimentele werkvloei. (D) Hittekaartverspreiding van merkers spesifiek vir Purkinje (bo) en ander seltipes (middel). (E) Venn-diagram wat die aantal mitochondriale proteïene toon wat in die geklassifiseerde PN geïdentifiseer is. (F) Vulkaanplot van differensieel uitgedrukte proteïene in Mfn2cKO-neurone na 8 weke (betekenisafsnywaarde van 1.3). (G) Die kreatiwiteitsroete-analise toon die vyf belangrikste opregulerings- (rooi) en afregulerings- (blou) paaie in die Mfn2cKO PN geklassifiseer as 8 weke. Die gemiddelde uitdrukkingsvlak van elke opgespoorde proteïen word getoon. Grysskaal-hittekaart: aangepaste P-waarde. ns, nie belangrik nie.
Proteomika-data het getoon dat die proteïenuitdrukking van komplekse I, III en IV geleidelik afgeneem het. Komplekse I, III en IV het almal essensiële mtDNA-gekodeerde subeenhede bevat, terwyl kompleks II, wat slegs kerngekodeerd was, basies onaangeraak was (Figuur 2A en Figuur S2A). . In ooreenstemming met die proteomika-resultate, het immunohistochemie van serebellêre weefselseksies getoon dat die MTCO1 (mitochondriale sitochroom C-oksidase-subeenheid 1) subeenheidvlak van kompleks IV in PN geleidelik afgeneem het (Figuur 2B). Die mtDNA-gekodeerde subeenheid Mtatp8 is beduidend verminder (Figuur S2A), terwyl die bestendige vlak van die kerngekodeerde ATP-sintase-subeenheid onveranderd gebly het, wat ooreenstem met die bekende stabiele ATP-sintase-subare samestelling F1-kompleks wanneer mtDNA-uitdrukking stabiel is. Die vorming is konsekwent. Onderbreking (7). Evaluering van die mtDNA-vlak in die gesorteerde Mfn2cKO PN'e deur middel van intydse polimerase-kettingreaksie (qPCR) het die geleidelike afname in mtDNA-kopienommer bevestig. In vergelyking met die kontrolegroep, op 8 weke ouderdom, is slegs ongeveer 20% van die mtDNA-vlak behou (Figuur 2C). In ooreenstemming met hierdie resultate, is die konfokale mikroskopie-kleuring van Mfn2cKO PN'e gebruik om DNS op te spoor, wat die tydafhanklike verbruik van mitochondriale nukleotiede toon (Figuur 2D). Ons het gevind dat slegs sommige kandidate betrokke by mitochondriale proteïenafbraak en stresrespons opgereguleer is, insluitend Lonp1, Afg3l2 en Clpx, en OXPHOS-komplekssamestellingsfaktore. Geen beduidende veranderinge in die vlakke van proteïene betrokke by apoptose is waargeneem nie (Figuur S2B). Net so het ons gevind dat die mitochondria en endoplasmiese retikulumkanale betrokke by kalsiumvervoer slegs geringe veranderinge het (Figuur S2C). Daarbenewens het die evaluering van outofagie-verwante proteïene geen beduidende veranderinge gevind nie, wat ooreenstem met die sigbare induksie van outofagosome wat in vivo waargeneem is deur immunohistochemie en elektronmikroskopie (Figuur S3). Die progressiewe OXPHOS-disfunksie in PN'e word egter vergesel deur duidelike ultrastrukturele mitochondriale veranderinge. Mitochondriale trosse kan gesien word in die selliggame en dendritiese bome van Mfn2cKO PN'e van 5 en 8 weke oud, en die binneste membraanstruktuur het diepgaande veranderinge ondergaan (Figuur S4, A en B). In ooreenstemming met hierdie ultrastrukturele veranderinge en 'n beduidende afname in mtDNA, het die analise van akute serebrale serebellêre snitte met tetrametielrodamienmetielester (TMRM) getoon dat die mitochondriale membraanpotensiaal in Mfn2cKO PN'e beduidend verminder is (Figuur S4C).
(A) Tydsverloopanalise van die ekspressievlak van die OXPHOS-kompleks. Beskou slegs proteïene met P<0.05 na 8 weke (tweerigting-ANOVA). Gestippelde lyn: Geen aanpassing in vergelyking met CTRL nie. (B) Links: 'n Voorbeeld van 'n serebellêre seksie gemerk met anti-MTCO1-teenliggaam (skaalbalk, 20 μm). Die area wat deur Purkinje-selliggame beset word, word deur geel bedek. Regs: Kwantifisering van MTCO1-vlakke (eenrigting-variansie-analise; n = 7 tot 20 selle geanaliseer van drie muise). (C) qPCR-analise van mtDNA-kopienommer in die gesorteerde PN (eenrigting-variansie-analise; n = 3 tot 7 muise). (D) Links: 'n Voorbeeld van 'n serebellêre sny gemerk met 'n anti-DNA-teenliggaam (skaalbalk, 20 μm). Die area wat deur Purkinje-selliggame beset word, word deur geel bedek. Regs: Kwantifisering van mtDNA-letsels (eenrigting-variansie-analise; n = 5 tot 9 selle van drie muise). (E) 'n Voorbeeld van 'n akute serebellêre snit wat mitoYFP + Purkinje-selle (pyl) in 'n heelsel-pleisterklemopname toon. (F) Kwantifisering van IV-kromme. (G) Verteenwoordigende opnames van depolariserende stroominspuiting in CTRL- en Mfn2cKO Purkinje-selle. Boonste spoor: Die eerste puls wat AP veroorsaak het. Onderste spoor: Maksimum AP-frekwensie. (H) Kwantifisering van postsinaptiese spontane insette (sPSP's). Die verteenwoordigende opnamespoor en sy zoemverhouding word in (I) getoon. Eenrigting-variansie-analise het n = 5 tot 20 selle van drie muise geanaliseer. Data word uitgedruk as gemiddelde ± SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Verteenwoordigende spore van spontane AP aangeteken met behulp van die geperforeerde pleisterklemmodus. Boonste spoor: Maksimum AP-frekwensie. Onderste spoor: zoem van 'n enkele AP. (K) Kwantifiseer die gemiddelde en maksimum AP-frekwensie volgens (J). Mann-Whitney-toets; n = 5 selle is van vier muise geanaliseer. Data word uitgedruk as gemiddelde ± SEM; nie belangrik nie.
Duidelike OXPHOS-skade is in die 8 weke oue Mfn2cKO PN opgespoor, wat aandui dat die fisiologiese funksie van neurone ernstig abnormaal is. Daarom het ons die passiewe elektriese eienskappe van OXPHOS-gebrekkige neurone op 4 tot 5 weke en 7 tot 8 weke geanaliseer deur heelsel-pleisterklemopnames in akute serebellêre snitte uit te voer (Figuur 2E). Onverwags was die gemiddelde rusmembraanpotensiaal en insetweerstand van Mfn2cKO-neurone soortgelyk aan die kontrole, hoewel daar subtiele verskille tussen selle was (Tabel 1). Net so is geen beduidende veranderinge in die stroom-spanning-verhouding (IV-kurwe) op 4 tot 5 weke oud gevind nie (Figuur 2F). Geen Mfn2cKO-neurone van 7 tot 8 weke oud het egter die IV-regime (hiperpolarisasiestap) oorleef nie, wat aandui dat daar 'n duidelike sensitiwiteit vir hiperpolarisasiepotensiaal in hierdie laat stadium is. In teenstelling hiermee, in Mfn2cKO-neurone, word die depolariserende strome wat herhalende aksiepotensiaal (AP)-ontladings veroorsaak, goed verdra, wat aandui dat hul algehele ontladingspatrone nie beduidend verskil van dié van 8 weke oue kontroleneurone nie (Tabel 1 en Figuur 2G). Net so was die frekwensie en amplitude van spontane postsinaptiese strome (sPSC's) vergelykbaar met dié van die kontrolegroep, en die frekwensie van gebeurtenisse het toegeneem van 4 weke tot 5 weke tot 7 weke tot 8 weke met 'n soortgelyke toename (Figuur 2, H en I). Die periode van sinaptiese volwassenheid in PN'e (25). Soortgelyke resultate is verkry na geperforeerde PN'e-kolle. Hierdie konfigurasie verhoed die moontlike kompensasie van sellulêre ATP-defekte, soos kan gebeur in heelsel-kolle-klampopname. In die besonder is die rusmembraanpotensiaal en spontane vuurfrekwensie van Mfn2cKO-neurone nie beïnvloed nie (Figuur 2, J en K). Opsommend dui hierdie resultate daarop dat PN'e met duidelike OXPHOS-disfunksie goed met hoëfrekwensie-ontladingspatrone kan handel, wat aandui dat daar 'n kompensasiemeganisme is wat hulle toelaat om byna normale elektrofisiologiese reaksies te handhaaf.
Data word uitgedruk as gemiddelde ± SEM (eenrigting-variansie-analise, Holm-Sidak se meervoudige vergelykingstoets; *P<0.05). Die eenheidsnommer word deur hakies aangedui.
Ons het ondersoek ingestel na of enige kategorie in die proteomika-datastel (Figuur 1G) weë insluit wat ernstige OXPHOS-tekort kan teenwerk, en sodoende verklaar waarom aangetaste PN byna normale elektrofisiologie kan handhaaf (Figuur 2, E tot K). Proteomika-analise het getoon dat die ensieme wat betrokke is by die katabolisme van vertakte kettingaminosure (BCAA) beduidend opgereguleer is (Figuur 3A en Figuur S5A), en die finale produk asetiel-CoA (CoA) of suksiniel CoA kan die trikarboksilaat in die arteriosklerose Suur (TCA) siklus aanvul. Ons het gevind dat die inhoud van BCAA transaminase 1 (BCAT1) en BCAT2 albei toegeneem het. Hulle kataliseer die eerste stap van BCAA-katabolisme deur glutamaat uit α-ketoglutaraat te genereer (26). Alle subeenhede wat die vertakte ketting keto suur dehidrogenase (BCKD) kompleks uitmaak, word opgereguleer (die kompleks kataliseer die daaropvolgende en onomkeerbare dekarboksilering van die gevolglike BCAA koolstofskelet) (Figuur 3A en Figuur S5A). Geen ooglopende veranderinge in BCAA self is egter in die gesorteerde PN gevind nie, wat moontlik te wyte is aan die verhoogde sellulêre opname van hierdie essensiële aminosure of die gebruik van ander bronne (glukose of melksuur) om die TCA-siklus aan te vul (Figuur S5B). PN'e wat OXPHOS kortkom, het ook verhoogde glutamienontbinding en transaminasie-aktiwiteite op 8 weke ouderdom getoon, wat weerspieël kan word deur die opregulering van die mitochondriale ensieme glutaminase (GLS) en glutamienpiruvaattransaminase 2 (GPT2) (Figuur 3, A en C). Dit is opmerklik dat die opregulering van GLS beperk is tot die gesplete isoform glutaminase C (GLS-GAC) (die verandering van Mfn2cKO/CTRL is ongeveer 4.5-voudig, P = 0.05), en die spesifieke opregulering daarvan in kankerweefsel kan mitochondriale bio-energie ondersteun. (27).
(A) Die hittekaart toon die vouverandering in proteïenvlak vir die gespesifiseerde roete na 8 weke. (B) Voorbeeld van 'n serebellêre sny gemerk met anti-PCx-teenliggaam (skaalbalk, 20 μm). Die geel pyl wys na die Purkinje-selliggaam. (C) Tydsverloop proteïenekspressie-analise geïdentifiseer as 'n belangrike kandidaat vir aterosklerose (meervoudige t-toets, *FDR <5%; n = 3-5 muise). (D) Bo: 'n Skematiese diagram wat die verskillende maniere toon om die gemerkte koolstof in die [1-13C]piruvaat-spoorder binne te gaan (d.w.s. via PDH of transarteriële roete). Onder: Die vioolkaart toon die persentasie enkelgemerkte koolstof (M1) wat omgeskakel is na aspartiensuur, sitroensuur en appelsuur na die merk van akute serebellêre snye met [1-13C]piruvaat (gepaarde t-toets; ** P <0.01). (E) Omvattende tydgeskiedenisanalise van die aangeduide pad. Beskou slegs proteïene met P<0.05 na 8 weke. Stippellyn: geen aanpassingswaarde (tweerigting-variansie-analise; * P <0.05; *** P <0.001). Data word uitgedruk as gemiddelde ± SEM.
In ons analise het BCAA-katabolisme een van die belangrikste opreguleringspaaie geword. Hierdie feit dui sterk daarop dat die ventilasievolume wat die TCA-siklus binnegaan, verander kan word in PN wat OXPHOS kort. Dit kan 'n belangrike vorm van neuronale metaboliese herbedrading verteenwoordig, wat 'n direkte impak op neuronale fisiologie en oorlewing kan hê tydens die instandhouding van ernstige OXPHOS-disfunksie. In ooreenstemming met hierdie hipotese het ons gevind dat die hoof anti-aterosklerotiese ensiem PCx opgereguleer is (Mfn2cKO/CTRL verander ongeveer 1.5 keer; Figuur 3A), wat die omskakeling van piruvaat na oksaloasetaat kataliseer (28), wat vermoedelik in breinweefsel voorkom. Die uitdrukking in is beperk tot astrosiete (29, 30). In ooreenstemming met die proteomika-resultate het konfokale mikroskopie getoon dat PCx-uitdrukking spesifiek en beduidend verhoog was in OXPHOS-gebrekkige PN'e, terwyl PCx-reaktiwiteit hoofsaaklik beperk was tot die aangrensende Bergmann-gliaselle van die kontrole (Figuur 3B). Om die waargenome opregulering van PCx funksioneel te toets, het ons akute serebellêre snitte met [1-13C]piruvaat-tracer behandel. Toe piruvaat deur piruvaatdehidrogenase (PDH) geoksideer is, het die isotoop-etiket daarvan verdwyn, maar dit word in die TCA-siklus-tussenprodukte opgeneem wanneer piruvaat deur vaskulêre reaksies gemetaboliseer word (Figuur 3D). Ter ondersteuning van ons proteomika-data het ons 'n groot aantal merkers van hierdie tracer in die aspartiensuur van Mfn2cKO-snitte waargeneem, terwyl sitroensuur en appelsuur ook 'n matige neiging gehad het, hoewel nie beduidend nie (Figuur 3D).
In die dopamienneurone van MitoPark-muise met mitochondriale disfunksie wat veroorsaak word deur dopamienneurone wat spesifiek die mitochondriale transkripsiefaktor A-geen (Tfam) vernietig (Figuur S6B), was PCx-uitdrukking ook beduidend opgereguleer (31), wat aandui dat asetoonsuurarteriosklerose. Die voorkoms van die siekte word gereguleer tydens die disfunksie van neuronale OXPHOS in die liggaam. Dit is opmerklik dat daar gevind is dat unieke ensieme (32-34) wat in neurone uitgedruk kan word wat met arteriosklerose geassosieer kan word, beduidend opgereguleer word in PN'e wat OXPHOS kortkom, soos propioniel-CoA-karboksilase (PCC-A), Maloniel-CoA skakel propioniel-CoA om na suksiniel-CoA en mitochondriale appelensiem 3 (ME3), wie se hoofrol is om piruvaat uit malaat te herwin (Figuur 3, A en C) (33, 35). Daarbenewens het ons 'n beduidende toename in die Pdk3-ensiem gevind, wat fosforileer en dus PDH inaktiveer (36), terwyl geen veranderinge in die Pdp1-ensiem wat PDH aktiveer of die PDH-ensiemkompleks self waargeneem is nie (Figuur 3A). Konsekwent, in Mern2cKO PN's, is die fosforilering van die α1-subeenheid α (PDHE1α) subeenheid van die piruvaatdehidrogenase E1-komponent van die PDH-kompleks in Ser293 (bekend om die ensiemaktiwiteit van PDH te inhibeer) verbeter (Figuur S6C) (Figuur S6C). Piruvaat het geen vaskulêre toegang nie.
Laastens het ons gevind dat die superroete van serien- en glisienbiosintese, die verwante mitochondriale folaat (1C) siklus en prolienbiosintese (Figuur 1G en Figuur S5C) almal volgens verslae beduidend opgereguleer word tydens die aktiveringsproses. Die omliggende weefsels word geaktiveer met mitochondriale disfunksie (5-7). Konfokale analise wat hierdie proteomika-data ondersteun, het getoon dat in PN met OXPHOS wat ontbreek, serebellêre snitte van 8 weke oue muise onderwerp is aan serienhidroksimetieltransferase 2 (SHMT2), 'n sleutelensiem van die mitochondriale folaatsiklus. Beduidende immuunrespons (Figuur S5D). In 13 CU-glukose-geïnkubeerde akute serebellêre snitte het metaboliese opsporingseksperimente die opregulering van serien- en prolienbiosintese verder bevestig, wat aandui dat die vloei van koolstofisovorme in serien en prolien toegeneem het (Figuur S5E). Aangesien die reaksies wat deur GLS en GPT2 bevorder word, verantwoordelik is vir die sintese van glutamaat vanaf glutamien en die transaminering tussen glutamaat en α-ketoglutaraat, dui hul opregulering daarop dat OXPHOS-gebrekkige neurone 'n verhoogde vraag na glutamaat het. Dit mag daarop gemik wees om die verhoogde biosintese van prolien te handhaaf (Figuur S5C). In teenstelling met hierdie veranderinge, het 'n proteomiese analise van serebellêre astrosiete van PN-spesifieke Mfn2cKO-muise getoon dat hierdie weë (insluitend alle antiperoksidases) nie beduidend in uitdrukking verander het nie, wat dus demonstreer dat hierdie metaboliese herleiding selektief is vir afgebreekte PN (Fig. S6, D tot G).
Opsommend het hierdie ontledings beduidend verskillende patrone van temporale aktivering van spesifieke metaboliese weë in PN'e aan die lig gebring. Alhoewel abnormale neuronale mitochondriale funksie kan lei tot vroeë aterosklerose en 1C-hermodellering (Figuur 3E en Figuur S5C), en selfs voorspelbare veranderinge in die uitdrukking van I- en IV-komplekse, is die veranderinge in serien de novo-sintese eers in die laat stadiums duidelik. OXPHOS-disfunksie (Figuur 3E en Figuur S5C). Hierdie bevindinge definieer 'n opeenvolgende proses waarin die stres-geïnduseerde mitochondriale (1C-siklus) en sitoplasmiese (serienbiosintese) sinergisties reageer met die toename in aterosklerose in die TCA-siklus om neuronale metabolisme te hervorm.
8 weke oue OXPHOS-gebrekkige PN'e kan hoëfrekwensie-opwekkingsaktiwiteit handhaaf en beduidende metaboliese herverbinding ondergaan om te kompenseer vir mitochondriale disfunksie. Hierdie ontdekking skep 'n interessante moontlikheid dat selfs op hierdie oomblik, hierdie selle ook terapeutiese intervensie kan ontvang om neurodegenerasie te vertraag of te voorkom. Ons het hierdie moontlikheid opgelos deur twee onafhanklike intervensies. In die eerste metode het ons 'n Cre-afhanklike adeno-geassosieerde virus (AAV) vektor ontwerp sodat MFN2 selektief uitgedruk kan word in OXPHOS-gebrekkige PN'e in vivo (Figuur S7A). Die AAV wat kodeer vir MFN2 en die fluorescerende verslaggewergeen mCherry (Mfn2-AAV) is in vitro in primêre neuronkulture geverifieer, wat veroorsaak het dat MFN2 op 'n Cre-afhanklike wyse uitgedruk word en die mitochondriale morfologie gered het, waardeur neuromutasie in Mfn2cKO neurone voorkom word (Figuur S7, B, D en E). Vervolgens het ons in vivo eksperimente uitgevoer om 8 weke oue Mfn2-AAV stereotakties aan die serebellêre korteks van Mfn2cKO- en kontrolemuise af te lewer, en 12 weke oue muise geanaliseer (Figuur 4A). Die behandelde Mfn2cKO-muise het gesterf (Figuur 1, A en B) (16). Virale transduksie in vivo het gelei tot selektiewe uitdrukking van PN in sommige serebellêre sirkels (Figuur S7, G en H). Die inspuiting van die kontrole-AAV wat slegs mCherry uitdruk (Ctrl-AAV) het geen beduidende effek op die graad van neurodegenerasie in Mfn2cKO-diere gehad nie. In teenstelling hiermee het die analise van Mfn2cKO's wat met Mfn2-AAV getransduseer is, 'n beduidende beskermende effek van die PN-sellaag getoon (Figuur 4, B en C). In die besonder blyk die neurondigtheid byna ononderskeibaar te wees van die kontrolediere (Figuur 4, B en C, en Figuur S7, H en I). Die uitdrukking van MFN1, maar nie MFN2 nie, is ewe effektief in die redding van neuronale dood (Figuur 4C en Figuur S7, C en F), wat aandui dat die uitdrukking van ektopiese MFN1 die gebrek aan MFN2 effektief kan aanvul. Verdere analise op die enkele PN-vlak het getoon dat Mfn2-AAV die ultrastruktuur van mitochondria grootliks gered het, mtDNA-vlakke genormaliseer het, en die hoë uitdrukking van die anti-angiogenese-merker PCx ​​​​omgekeer het (Figuur 4, C tot E). Visuele inspeksie van die geredde Mfn2cKO-muise in 'n rustende toestand het getoon dat hul postuur en motoriese simptome (beweging S1 tot S3) verbeter is. Ten slotte toon hierdie eksperimente dat vertraagde herinvoering van MFN2 in PN'e wat ernstig tekort aan OXPHOS het, voldoende is om mtDNA-verbruik om te keer en aterosklerose te veroorsaak, waardeur aksondegenerasie en neuronale dood in vivo voorkom word.
(A) 'n Skema wat die eksperimentele skedule toon vir die inspuiting van AAV wat vir MFN2 kodeer wanneer die aangeduide metaboliese pad geaktiveer word. (B) Verteenwoordigende konfokale beelde van 12 weke oue serebellêre snitte getransduseer na 8 weke in Mfn2cKO-muise en gemerk met anti-Calbindin-teenliggaam. Regs: Skalering van aksonvesels. Die skaal van die aksonzoom is 450 en 75 μm. (C) Links: Kwantifisering van Purkinje-seldigtheid in die AAV-transduksielus (AAV+) (eenrigting-variansie-analise; n = 3 muise). Regs: mtDNA-fokusanalise in getransduseerde PN na week 12 (ongepaarde t-toets; n = 6 selle van drie muise). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Verteenwoordigende transmissie-elektronmikrograwe van PN's van Mfn2cKO-serebellêre snitte getransduseer met die aangeduide virale vektore. Die pienk masker illustreer die area wat deur dendriete beset word, en die geel gestippelde vierkant illustreer die zoom wat regs verskaf word; n verteenwoordig die kern. Skaalbalk, 1μm. (E) toon 'n voorbeeld van PCx-kleuring in PN getransduseer na 12 weke. Skaalbalk, 20μm. OE, oorekspressie; FC, vouverandering.
Laastens het ons die belangrikheid van peroksidase-geïnduseerde seloorlewing in PN'e wat OXPHOS-disfunksie ervaar het, ondersoek. Ons het mCherry gegenereer wat kodeer vir AAV-shRNA (kort haarspeld-RNA) wat spesifiek op muis PCx mRNA (AAV-shPCx) gemik is, en die virus of sy gekorrelde beheer (AAV-scr) in die serebellum van Mfn2cKO-muise ingespuit. Die inspuiting is in die vierde week van ouderdom uitgevoer (Figuur 5A) om effektiewe PCx-onderdrukking te bereik gedurende die tydperk wanneer PCx-uitdrukking toegeneem het (Figuur 3C) en die PN-sellaag steeds ongeskonde was (Figuur 1A). Dit is opmerklik dat die onderdrukking van PCx (Figuur S8A) lei tot 'n beduidende versnelling van PN-dood, wat beperk is tot die besmette ring (Figuur 5, B en C). Om die meganisme van die metaboliese effekte wat deur PCx-opregulering veroorsaak word, te verstaan, het ons die redoksstatus van PN'e bestudeer na PCx-afskakeling en AAV-gemedieerde optiese biosensor Grx1-roGFP2 wat gelyktydig uitgedruk is (Figuur S8, B tot D) om glutathion se relatiewe verandering in peptied-redokspotensiaal te evalueer (38). Daarna het ons twee-foton fluoresensie-leeftydsbeeldmikroskopie (FLIM) in akute breinskyfies van 7 weke oue Mfn2cKO of kontrole-werpselmaats uitgevoer om potensiële veranderinge in sitoplasmiese redoksstatus op te spoor na die verifikasie van FLIM-toestande (Figuur S8, E tot G). Die analise het 'n beduidende toename in die oksidasietoestand van 'n enkele Mfn2cKO PN'e sonder PCx-uitdrukking getoon, wat verskil van kontrole-neurone of Mfn2cKO PN'e wat slegs gekrummelde shRNA uitdruk (Figuur 5, D en E). Toe PCx-ekspressie afgereguleer is, het die persentasie Mfn2cKO PN'e wat 'n hoogs geoksideerde toestand toon, met meer as drie keer toegeneem (Figuur 5E), wat aandui dat PCx-opregulering die redokskapasiteit van gedegenereerde neurone gehandhaaf het.
(A) 'n Skema wat die eksperimentele skedule toon vir die inspuiting van AAV wat kodeer vir shPCx wanneer die aangeduide metaboliese pad geaktiveer word. (B) Verteenwoordigende konfokale foto's van 8 weke oue serebellêre seksies in Mfn2cKO-muise getransduseer en gemerk met anti-calcineurin-teenliggaam na 4 weke. Skaalbalk, 450 μm. (C) Kwantifisering van Purkinje-seldigtheid in AAV-getransduseerde lusse (eenrigting-variansie-analise; n = 3 tot 4 muise). Data word uitgedruk as gemiddeld ± SEM; ***P < 0.001. (D) Verteenwoordigende FLIM-prent toon die gemiddelde lewensduur van 7 weke oue PN wat glutatioon-redoks-sensor Grx1-roGFP2 uitdruk onder die gespesifiseerde eksperimentele toestande. LUT (opsoektabel) verhouding: oorlewingstydinterval (in pikosekondes). Skaalbalk, 25 μm. (E) Die histogram toon die verspreiding van Grx1-roGFP2 lewensduurwaardes van (D) (n=158 tot 368 selle in twee muise onder elke toestand). Die sirkelgrafiek bo elke histogram toon die aantal selle met beduidend langer (rooi, geoksideer) of korter (blou, verminder) lewensduurwaardes, wat 1 SD van die gemiddelde lewensduurwaarde in CTRL-AAV-scr oorskry. (F) Die voorgestelde model toon die beskermende effek van opregulering van neuronale PCx.
Alles in ag genome toon die data wat ons hier verskaf dat die heruitdrukking van MFN2 gevorderde PN met ernstige OXPHOS-tekort, ernstige mtDNA-uitputting en uiters abnormale ista-agtige morfologie volledig kan red, en sodoende voortdurende vordering selfs in gevorderde siektes kan bied. Neurodegenerasie verskaf omkeerbare bewyse van die stadium voor seldood. Hierdie mate van metaboliese buigsaamheid word verder beklemtoon deur die vermoë van neurone om aterosklerose te veroorsaak (’n herbedrading van die TCA-siklus), wat PCx-uitdrukking in PN'e wat OXPHOS kortkom, inhibeer en seldood bevorder, en sodoende 'n beskermende rol speel (Figuur 5F).
In hierdie studie het ons bewys gelewer dat die reaksie van PN'e op OXPHOS-disfunksie is om geleidelik te konvergeer na TCA-siklus aterosklerose deur die differensiële aktiveringsroete wat deur metaboliese programme geaktiveer word. Ons het die proteomiese analise met baie komplementêre metodes bevestig en aan die lig gebring dat neurone, wanneer hulle deur ernstige mitochondriale disfunksie uitgedaag word, 'n voorheen onbekende vorm van metaboliese elastisiteit het. Tot ons verbasing dui die hele herbedradingsproses nie noodwendig op die terminale metaboliese toestand wat neurodegenerasie geleidelik en onomkeerbaar vergesel nie, maar ons data dui daarop dat dit 'n instandhoudingsneuron kan wees, selfs in die stadium voor seldood. Funksionele kompensasiemeganisme. Hierdie bevinding dui daarop dat neurone 'n aansienlike mate van metaboliese plastisiteit in die liggaam het. Hierdie feit bewys dat die latere herinvoering van MFN2 die uitdrukking van sleutel metaboliese merkers kan omkeer en PN-degenerasie kan voorkom. Inteendeel, dit inhibeer aterosklerose en versnel transseksuele senuwees.
Een van die fassinerendste bevindinge in ons navorsing is dat PN'e wat OXPHOS kortkom, die TCA-siklusmetabolisme kan verander deur ensieme op te reguleer wat spesifiek arteriosklerose stimuleer. Metaboliese herrangskikking is 'n algemene kenmerk van kankerselle, waarvan sommige staatmaak op glutamien om TCA-siklustussenprodukte aan te vul om reduserende ekwivalente te produseer, wat die respiratoriese ketting aandryf en die produksie van lipied- en nukleotiedbiosintese-voorlopers handhaaf (39, 40). 'n Onlangse studie het getoon dat in perifere weefsels wat OXPHOS-disfunksie ervaar, die herverbinding van glutamien/glutamaatmetabolisme ook 'n prominente kenmerk is (5, 41), waar die rigting van glutamientoegang tot die TCA-siklus afhang van die erns van OXPHOS-besering (41). Daar is egter 'n gebrek aan duidelike bewyse oor enige ooreenkoms van neuronale metaboliese plastisiteit in die liggaam en die moontlike relevansie daarvan in die siektekonteks. In 'n onlangse in vitro-studie is getoon dat primêre kortikale neurone glutamaatpoele mobiliseer vir neurotransmissie, waardeur oksidatiewe metabolisme en aterosklerose onder metaboliese strestoestande bevorder word (42). Dit is opmerklik dat piruvaatkarboksilering onder die farmakologiese inhibisie van die TCA-siklusensiem suksinaatdehidrogenase, geglo word dat piruvaatkarboksilering die sintese van oksaloasetaat in gekweekte serebellêre granuleneurone handhaaf (34). Die fisiologiese relevansie van hierdie meganismes vir breinweefsel (waar aterosklerose geglo word hoofsaaklik tot astrosiete beperk te wees) het egter steeds belangrike fisiologiese betekenis (43). In hierdie geval toon ons data dat PN'e wat deur OXPHOS in die liggaam beskadig word, oorgeskakel kan word na BCAA-afbraak en piruvaatkarboksilering, wat die twee hoofbronne van aanvulling van TCA-poeltussenprodukte is. Alhoewel die vermeende bydrae van BCAA-katabolisme tot neuronale energiemetabolisme voorgestel is, benewens die rol van glutamaat en GABA vir neurotransmissie (44), is daar steeds geen bewyse vir hierdie meganismes in vivo nie. Daarom is dit maklik om te spekuleer dat disfunksionele PN'e outomaties kan vergoed vir die verbruik van TCA-tussenprodukte wat deur die assimilasieproses gedryf word deur aterosklerose te verhoog. In die besonder mag opregulering van PCx nodig wees om 'n verhoogde vraag na aspartiensuur te handhaaf, wat voorgestel word in prolifererende selle met mitochondriale disfunksie (45). Ons metabolomika-analise het egter geen beduidende veranderinge in die bestendige vlak van aspartiensuur in Mfn2cKO PN's getoon nie (Figuur S6A), wat vermoedelik die verskillende metaboliese benutting van aspartiensuur tussen prolifererende selle en post-mitotiese neurone weerspieël. Alhoewel die presiese meganisme van PCx-opregulering in disfunksionele neurone in vivo nog gekarakteriseer moet word, het ons gedemonstreer dat hierdie voortydige reaksie 'n belangrike rol speel in die handhawing van die redoks-toestand van neurone, wat gedemonstreer is in FLIM-eksperimente op serebellêre snitte. In die besonder kan die voorkoming van PN's om PCx op te reguleer, lei tot 'n meer geoksideerde toestand en seldood versnel. Die aktivering van BCAA-afbraak en die karboksilering van piruvaat is nie maniere om die perifere weefsels van mitochondriale disfunksie te karakteriseer nie (7). Daarom blyk hulle 'n prioriteitskenmerk van OXPHOS-gebrekkige neurone te wees, selfs al is dit nie die enigste kenmerk wat belangrik is vir neurodegenerasie nie.
Serebellêre siekte is 'n heterogene tipe neurodegeneratiewe siekte wat gewoonlik as ataksie manifesteer en dikwels PN'e beskadig (46). Hierdie neuronpopulasie is veral kwesbaar vir mitochondriale disfunksie omdat hul selektiewe degenerasie in muise voldoende is om baie van die motoriese simptome wat menslike spinocerebellêre ataksie kenmerk, te reproduseer (16, 47, 48). Volgens berigte word 'n transgeniese muismodel met 'n mutante geen geassosieer met menslike spinocerebellêre ataksie en het mitochondriale disfunksie (49, 50), wat die belangrikheid beklemtoon om die gevolge van OXPHOS-tekort in PNPH te bestudeer. Daarom is dit veral geskik om hierdie unieke neuronpopulasie effektief te isoleer en te bestudeer. Aangesien PN'e egter baie sensitief is vir druk en 'n lae proporsie van die hele serebellêre selpopulasie uitmaak, is selektiewe skeiding van hulle as hele selle vir baie omika-gebaseerde studies steeds 'n uitdagende aspek. Alhoewel dit byna onmoontlik is om absolute afwesigheid van kontaminasie van ander seltipes (veral volwasse weefsels) te bereik, het ons 'n effektiewe dissosiasiestap met FACS gekombineer om 'n voldoende aantal lewensvatbare neurone vir stroomaf proteomika-analise te verkry, en het ons 'n redelik hoë proteïendekking (ongeveer 3000 proteïene) in vergelyking met die bestaande datastel van die hele serebellum (51). Deur die lewensvatbaarheid van hele selle te bewaar, laat die metode wat ons hier verskaf ons nie net toe om die veranderinge in die metaboliese weë in die mitochondria na te gaan nie, maar ook om die veranderinge in sy sitoplasmiese eweknieë na te gaan, wat die gebruik van mitochondriale membraanetikette aanvul om seltipe te verryk. Die nuwe metode vir die aantal mitochondria in komplekse weefsels (52, 53). Die metode wat ons beskryf, hou nie net verband met die studie van Purkinje-selle nie, maar kan maklik op enige tipe sel toegepas word om metaboliese veranderinge in siek breine aan te spreek, insluitend ander modelle van mitochondriale disfunksie.
Laastens het ons 'n terapeutiese venster tydens hierdie metaboliese herrangskikkingsproses geïdentifiseer wat die belangrikste tekens van sellulêre stres heeltemal kan omkeer en neuronale degenerasie kan voorkom. Daarom kan die begrip van die funksionele implikasies van die herbedrading wat hier beskryf word, fundamentele insigte bied in moontlike behandelings vir die handhawing van neuronale lewensvatbaarheid tydens mitochondriale disfunksie. Toekomstige navorsing wat daarop gemik is om veranderinge in energiemetabolisme in ander breinseltipes te dissekteer, is nodig om die toepaslikheid van hierdie beginsel op ander neurologiese siektes ten volle te openbaar.
MitoPark-muise is voorheen beskryf (31). C57BL/6N-muise met loxP-flankerende Mfn2-gene is voorheen beskryf (18) en gekruis met L7-Cre-muise (23). Die gevolglike dubbel heterosigotiese nageslag is toe gekruis met homosigotiese Mfn2loxP/Mfn2loxP-muise om Purkinje-spesifieke geen-uitklop vir Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) te genereer. In 'n subgroep van paring is die Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP-alleel (stop-mtYFP) deur addisionele kruisings ingebring (20). Alle dierprosedures is uitgevoer in ooreenstemming met Europese, nasionale en institusionele riglyne en goedgekeur deur LandesamtfürNatur van Umwelt en Verbraucherschutz, Noordryn-Wesfale, Duitsland. Dierwerk volg ook die riglyne van die Europese Federasie van Laboratoriumdierwetenskapverenigings.
Nadat die swanger vrou se servikale ontwrigting verdoof is, word die muisembrio geïsoleer (E13). Die korteks is gedissekteer in Hanks se Gebalanseerde Soutoplossing (HBSS) aangevul met 10 mM Hepes en deurgegee aan Dulbecco se Gemodifiseerde Eagle-medium wat papaiïen (20 U/ml) en sisteïen (1μg/ml) bevat. Inkubeer die weefsel in DMEM) en dissosieer dit deur ensiematiese vertering. Ml) by 37°C vir 20 minute, en dan meganies gemaal in DMEM aangevul met 10% fetale beeserum. Selle is gesaai op glasdekglasies bedek met polilisien teen 'n digtheid van 2×106 per 6 cm kultuurbakkie of teen 'n digtheid van 0.5×105 selle/cm2 vir beeldontleding. Na 4 uur is die medium vervang met Neurobasal serumvrye medium wat 1% B27-aanvulling en 0.5 mM GlutaMax bevat. Die neurone is toe dwarsdeur die eksperiment by 37°C en 5% CO2 gehou en een keer per week gevoer. Om rekombinasie in vitro te veroorsaak, is 3μl (24-putjie-kweekbakkie) of 0.5μl (24-putjie-plaat) van die volgende AAV9-virusvektor gebruik om neurone op die tweede dag in vitro te behandel: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, katalogusnommer 105530-AAV9) en AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, katalogusnommer 105545-AAV9).
Muis Mfn1 en Mfn2 komplementêre DNS (verkry van Addgene plasmied #23212 en #23213, onderskeidelik) is gemerk met die V5-volgorde (GKPIPNPLLGLDST) by die C-terminus, en is saamgesmelt met mCherry in raam deur die T2A-volgorde. Grx1-roGFP2 is 'n geskenk van Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Deur die tdTomato-kasset te vervang met behulp van konvensionele kloningsmetodes, is die kasset gesubkloneer in die pAAV-CAG-FLEX-tdTomato-ruggraat (Addgene verwysingsnommer 28306) om pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 en pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2-vektore te genereer. 'n Soortgelyke strategie is gebruik om die kontrolevektor pAAV-CAG-FLEX-mCherry te genereer. Om die AAV-shPCx-konstruk te genereer, is 'n plasmied AAV-vektor (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) nodig, wat die DNS-volgorde bevat wat kodeer vir die shRNA wat op muis-PCx teiken (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Onder die beheer van die U6-promotor word mCherry gebruik onder die beheer van die CMV-promotor. Die produksie van hulp-AAV-vektore is uitgevoer volgens die vervaardiger se instruksies (Cell Biolabs). Kortliks, gebruik 'n oordragplasmied wat mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) oorgangsdra. Transfeksie van 293AAV-selle-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) of Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) koderende geen, sowel as koderende AAV1-kapsiedproteïen en bykomende proteïen. Verpakking van plasmiedplasmied, met behulp van die kalsiumfosfaatmetode. Die ru-virussupernatant is verkry deur vries-ontdooi siklusse in 'n droëys/etanolbad en selle is geliseer in fosfaatgebufferde soutoplossing (PBS). Die AAV-vektor is gesuiwer deur diskontinue jodiksanolgradiënt-ultrasentrifugering (24 uur teen 32 000 rpm en 4°C) en gekonsentreer met behulp van 'n Amicon ultra-15 sentrifugale filter. Genoomtiter van AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 genoomkopie (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX was soos voorheen beskryf (54), gemeet deur intydse kwantitatiewe PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) en AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Primêre neurone is afgeskraap in yskoue 1x PBS, gepelleteer en toe gehomogeniseer in 0.5% Triton X-100 / 0.5% natriumdeoksicholaat/PBS-lisebuffer wat fosfatase en protease-inhibeerder bevat (Roche). Proteïenkwantifisering is uitgevoer deur die bisinchoniensuur-toets (Thermo Fisher Scientific) te gebruik. Die proteïene is toe geskei deur SDS-poliakrielamiedgelelektroforese en toe op 'n polivinilideenfluoriedmembraan (GE Healthcare) geblot. Blokkeer nie-spesifieke plekke en inkubeer met die primêre teenliggaam (sien Tabel S1 vir besonderhede) in 5% melk in TBST (Tris-gebufferde soutoplossing met Tween), wasstappe en sekondêre teenliggaam in TBST Incubate. Inkubeer oornag met die primêre teenliggaam by +4°C. Na was, dien die sekondêre teenliggaam vir 2 uur by kamertemperatuur toe. Daarna, deur dieselfde blot met 'n anti-β-aktien-teenliggaam te inkubeer, is dieselfde lading bevestig. Deteksie deur omskakeling na chemiluminessensie en verbetering van chemiluminessensie (GE Healthcare).
Die neurone wat voorheen op glasdekglase gesaai is, is met 4% paraformaldehied (PFA)/PBS op die gespesifiseerde tydpunt by kamertemperatuur vir 10 minute gefikseer. Die dekglase word eers met 0.1% Triton X-100/PBS vir 5 minute by kamertemperatuur gepenetreer, en dan in blokkeringsbuffer [3% beeserumalbumien (BSA)/PBS]. Op die tweede dag is die dekglase met blokkeringsbuffer gewas en vir 2 uur by kamertemperatuur met die toepaslike fluorofoor-gekonjugeerde sekondêre teenliggaam geïnkubeer; laastens is die monsters deeglik in PBS gewas met 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) wat teengekleur is en dan op die mikroskoopglasie met Aqua-Poly/Mount gefikseer.
Muise (manlik en wyfie) is verdoof deur intraperitoneale inspuiting van ketamien (130 mg/kg) en xylasien (10 mg/kg) en subkutaan toegedien met karprofen-pynstiller (5 mg/kg). Hulle is in 'n stereotaktiese instrument (Kopf) geplaas wat met 'n warm kussing toegerus is. Maak die skedel bloot en gebruik 'n tandboor om die deel van die serebellêre korteks wat ooreenstem met die mis-been te dun (van lambda: stert 1.8, lateraal 1, wat ooreenstem met lobule IV en V). Gebruik 'n geboë spuitnaald om versigtig 'n klein gaatjie in die skedel te skep om te verhoed dat die vaskulatuur hieronder ontwrig word. Dan word die dun getrekte glaskapillêr stadig in die mikrogat geplaas (van -1.3 tot -1 aan die ventrale kant van die dura mater), en 200 tot 300 nl AAV word verskeie kere met handspuite (Narishige) by lae druk oor 'n tydperk van 10 tot 20 minute in die mikro-inspuiter (Narishige) ingespuit. Na die infusie, plaas die kapillêre vir nog 10 minute om die virus heeltemal te laat versprei. Nadat die kapillêre verwyder is, word die vel versigtig vasgeheg om wondontsteking te verminder en die dier toe te laat om te herstel. Die diere is vir 'n paar dae na die operasie met pynstillers (caspofen) behandel, waartydens hul fisiese toestand noukeurig gemonitor is en daarna op die vasgestelde tydstip geëuthanaseer is. Alle prosedures is uitgevoer in ooreenstemming met Europese, nasionale en institusionele riglyne en is goedgekeur deur LandesamtfürNatur van Umwelt en Verbraucherschutz, Noordryn-Wesfale, Duitsland.
Die diere is verdoof met ketamien (100 mg/kg) en xilasien (10 mg/kg), en die hart is eers met 0.1 M PBS geperfuseer, en toe met 4% PFA in PBS. Die weefsel is gedissekteer en oornag by 4°C in 4% PFA/PBS gefikseer. 'n Vibrerende mes (Leica Microsystems GmbH, Wene, Oostenryk) is gebruik om sagittale snitte (50 μm dik) van die gefikseerde brein in PBS voor te berei. Tensy anders vermeld, is kleuring van vrydrywende snitte uitgevoer soos hierbo beskryf (13) by kamertemperatuur en onder roering. Kortliks, eers is die verkrygde snitte met 0.5% Triton X-100/PBS vir 15 minute by kamertemperatuur permeabiliseer; vir sommige epitope (Pcx en Shmt2), deur die snitte vir 25 minute in tris-EDTA-buffer by 80°C (pH 9) te verhit in plaas van hierdie stap. Vervolgens is die seksies oornag met die primêre teenliggaam (sien Tabel S1) in blokkeringsbuffer (3% BSA/PBS) by 4°C geïnkubeer terwyl geroer is. Die volgende dag is die seksies met blokkeringsbuffer gewas en vir 2 uur by kamertemperatuur met die toepaslike fluorofoor-gekonjugeerde sekondêre teenliggaam geïnkubeer; laastens is die seksies deeglik in PBS gewas, teengekleur met DAPI, en dan met AquaPolymount op 'n mikroskoopplaatjie gefikseer.
'n Laserskandeer-konfokale mikroskoop (TCS SP8-X of TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) toegerus met 'n witliglaser en 'n 405-diode ultravioletlaser is gebruik om die monster af te beeld. Deur die fluorofoor op te wek en die sein met Hybrid Detector (HyDs) te versamel, is LAS-X-sagteware gebruik om gestapelde beelde te versamel wat ooreenstem met Nyquist-steekproefneming in opeenvolgende modus: vir nie-kwantitatiewe panele is dit hoogs dinamiese seine (byvoorbeeld in somatiese selle en dendriete) (mtYFP). Gebruik HyD om die aantal PN's in BrightR-modus op te spoor). Hekbewegings van 0.3 tot 6 ns word toegepas om agtergrond te verminder.
Intydse beeldvorming van gesorteerde selle. Na sortering in Neurobasal-A-medium wat 1% B27-aanvulling en 0.5 mM GlutaMax bevat, is selle onmiddellik op poli-l-lisien-bedekte glasplaatjies (μ-Slide8 Well, Ibidi, katalogusnommer 80826) gesaai, en dit dan vir 1 uur by 37°C en 5% CO2 gehou om die selle toe te laat om te vestig. Intydse beeldvorming is uitgevoer op 'n Leica SP8 laserskandeer-konfokale mikroskoop toegerus met 'n wit laser, HyD, 63×[1.4 numeriese diafragma (NA)] olieobjektieflens en 'n verhittingsplatform.
Die muis is vinnig met koolstofdioksied verdoof en onthoof, die brein is vinnig van die skedel verwyder en in 'n sagittale snit van 200 μm dik (vir die 13C-etiketteringseksperiment) of 275 μm dik (vir twee foton-eksperimente) gesny, gevul met die volgende materiale. Die roomys (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Duitsland) is gevul met die volgende stowwe: 125 mM yskoue, koolstofversadigde (95% O2 en 5% CO2) lae Ca2 + kunsmatige serebrospinale vloeistof (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriumfosfaatbuffer, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukose, 0.5 mM CaCl2 en 3.5 mM MgCl2 (osmotiese druk van 310 tot 330 mmol). Plaas die verkrygde breinskyfies oor na 'n voor-inkubasiekamer wat hoër Ca2 + ACSF bevat (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriumfosfaatbuffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukose, 1.0 mM CaCl2 en 2.0 mM MgCl2) Medium) pH 7.4 en 310 tot 320 mmol).
Tydens die beeldvormingsproses is die snye na 'n toegewyde beeldvormingskamer geskuif, en die eksperiment is uitgevoer onder deurlopende ACSF-perfusie teen 'n konstante temperatuur van 32° tot 33°C. 'n Multifoton-laserskandeermikroskoop (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) toegerus met 'n Leica 25x objektieflens (NA 0.95, water), Ti: Sapphire-laser (Chameleon Vision II, Coherent) is vir snybeeldvorming gebruik. FLIM-module (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM van Grx1-roGFP2. Die veranderinge in die sitoplasmiese redokstoestand van PN'e is gemeet deur twee-foton FLIM in sagittale breinsnitte, waar die Grx1-roGFP2 biosensor PN'e geteiken het. In die PN-laag word die verkrygingsveld ongeveer 50 tot 80 μm onder die snyoppervlak gekies om te verseker dat daar 'n lewensvatbare PN is (dit wil sê die gebrek aan kralestruktuur of neuronale morfologiese veranderinge langs die dendriete) en die dubbel positiewe roGFP2 sensor en AAV-koderende shRNA PCx of sy beheervolgorde (elk wat mCherry saam uitdruk). Versamel enkelstapelbeelde met 2x digitale zoom [opwekkingsgolflengte: 890 nm; 512 nm 512 pixels]. Deteksie: interne HyD, fluoressien-isotiosianaat (FITC) filtergroep] en beeldgemiddelde binne 2 tot 3 minute word gebruik om te verseker dat genoeg fotone versamel word (1000 fotone in totaal) vir krommepassing. Die sensitiwiteit van die Grx1-roGFP2-sonde en die verifikasie van FLIM-toestande is uitgevoer deur die lewensduurwaarde van roGFP2 te monitor wanneer eksogene 10 mM H2O2 by die perfusie-ACSF gevoeg is (om oksidasie te maksimeer, wat lei tot verhoogde lewensduur), en dan 2 mM ditiotreitol by te voeg (minimaliseer die graad van reduksie, wat lei tot 'n afname in lewensduur) (Figuur S8, D tot G). Gebruik FLIMfit 5.1.1 sagteware om die verkrygde resultate te analiseer, pas die enkele eksponensiële vervalkurwe van die hele beeld by die gemete IRF (instrumentresponsfunksie), en χ2 is ongeveer 1. Om die lewensduur van 'n enkele PN te bereken, is die masker rondom die senuweeliggaam handmatig geteken, en die gemiddelde lewensduur in elke masker is vir kwantifisering gebruik.
Mitochondriale potensiaalanalise. Nadat die akute gedeelte geïnkubeer is met 100 nM TMRM wat direk by die geperfuseerde ACSF vir 30 minute gevoeg is, is die mitochondriale potensiaalveranderinge van PN's gemeet deur 'n twee-fotonmikroskoop. TMRM-beelding is uitgevoer deur die probe by 920 nm te eksiteer en interne HyD (tetrametielrodamien-isotiosianaat: 585/40 nm) te gebruik om seine in te samel; deur dieselfde eksitasiegolflengte te gebruik, maar 'n ander interne HyD (FITC: 525/50) te gebruik om mtYFP af te beeld. Gebruik ImageJ se Image Calculator-inprop om mitochondriale potensiaal op enkelselvlak te evalueer. Kortliks, die inpropvergelyking: sein = min (mtYFP, TMRM) word gebruik om die mitochondriale streek te identifiseer wat die TMRM-sein in Purkinje Somali in die enkelstapel-konfokale beeld van die ooreenstemmende kanaal toon. Dan word die pixelarea in die resulterende masker gekwantifiseer en dan genormaliseer op die ooreenstemmende drempel-enkelstapelbeeld van die mtYFP-kanaal om die mitochondriale fraksie te verkry wat die mitochondriale potensiaal toon.
Die beeld is gedekonvolueer met Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) sagteware. Vir die geskandeerde prente van teëls word die montage van 'n enkele teël gemaak met behulp van die outomatiese stik-algoritme wat deur LAS-X sagteware verskaf word. Na beeldkalibrasie, gebruik ImageJ en Adobe Photoshop om die beeld verder te verwerk en die helderheid en kontras eenvormig aan te pas. Gebruik Adobe Illustrator vir grafiese voorbereiding.
mtDNA-fokusanalise. Die aantal mtDNA-letsels is gekwantifiseer op serebellêre snitte wat met teenliggaampies teen DNS gemerk is deur middel van 'n konfokale mikroskoop. Elke teikenarea is geskep vir die selliggaam en die kern van elke sel, en die onderskeie area is bereken met behulp van die Multi Measure-inprop (ImageJ-sagteware). Trek die kernarea af van die selliggaamarea om die sitoplasmiese area te verkry. Laastens is die Analyze Particles-inprop (ImageJ-sagteware) gebruik om outomaties die sitoplasmiese DNS-punte wat mtDNA op die drempelbeeld aandui, te kwantifiseer, en die verkrygde resultate is genormaliseer na die PN-gemiddelde van CTRL-muise. Die resultate word uitgedruk as die gemiddelde aantal nukleosiede per sel.
Proteïen-ekspressie-analise. Gebruik ImageJ se Image Calculator-invoegtoepassing om proteïen-ekspressie in PN op enkelselvlak te evalueer. Kortliks, in die enkellaag-konfokale beeld van die ooreenstemmende kanaal, deur die vergelyking: sein = min (mtYFP, teenliggaam), word die mitochondriale gebied wat immunoreaktiwiteit teenoor 'n sekere teenliggaam in Purkina toon, geïdentifiseer. Dan word die pixelarea in die resulterende masker gekwantifiseer en dan genormaliseer op die ooreenstemmende drempel-enkelstapelbeeld van die mtYFP-kanaal om die mitochondriale fraksie van die vertoonde proteïen te verkry.
Purkinje-seldigtheidsanalise. Die Cell Counter-invoegtoepassing van ImageJ is gebruik om Purkinje-digtheid te evalueer deur die aantal getelde Purkinje-selle te deel deur die lengte van die serebellêre ring wat deur die getelde selle beset word.
Monstervoorbereiding en -versameling. Die breine van die kontrolegroep en Mfn2cKO-muise is gefikseer in 2% PFA/2.5% glutaraldehied in 0.1 M fosfaatbuffer (PB), en toe is koronale snitte voorberei met behulp van siliate (Leica Mikrosysteme GmbH, Wene, Oostenryk) (Dikte 50 tot 60 μm). Daarna is hulle vir 1 uur by kamertemperatuur in PB-buffer in 1% os-tetraoksied en 1.5% kaliumferrosianied gefikseer. Die snitte is drie keer met gedistilleerde water gewas en toe vir 20 minute met 70% etanol wat 1% uranielasetaat bevat, gekleur. Die snitte is toe gedehidreer in gegradeerde alkohol en in Durcupan ACM (Araldite-giethars M) epoksiehars (Electron Microscopy Sciences, katalogusnommer 14040) tussen silikonbedekte glasskyfies ingebed, en uiteindelik by 60°C vir 48 uur in die oond gepolimeriseer. Die serebellêre korteksarea is geselekteer en 50 nm ultradun snitte is gesny op Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wene, Oostenryk) en gekies op 'n 2×1 mm koperspleetrooster bedek met polistireenfilm. Die snitte is gekleur met 'n oplossing van 4% uranielasetaat in H2O vir 10 minute, gewas met H2O 'n paar keer, dan met Reynolds-loodsitraat in H2O vir 10 minute, en dan gewas met H2O 'n paar keer. Mikrograwe is geneem met 'n transmissie-elektronmikroskoop Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VSA) met behulp van 'n TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digitale kamera (TVIPS GmbH, Gauting, VSA, Duitsland).
Vir muise wat met AAV besmet is, is die brein geskei en in 'n 1 mm dik sagittale snit gesny, en die serebellum is met 'n fluoresensiemikroskoop ondersoek om die AAV-besmette ring te identifiseer (dit wil sê mCherry-ekspressie). Slegs eksperimente waarin AAV-inspuiting 'n baie hoë transduksie-effektiwiteit van die Purkinje-sellaag (d.w.s. byna die hele laag) in ten minste twee opeenvolgende serebellêre ringe tot gevolg het, word gebruik. Die AAV-getransduseerde lus is mikrodissekeer vir oornag na fiksasie (4% PFA en 2.5% glutaraldehied in 0.1 M kokoaatbuffer) en verder verwerk. Vir EPON-inbedding is die gefikseerde weefsel gewas met 0.1 M natriumkokoaatbuffer (Applichem), en geïnkubeer met 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) in 0.1 M natriumkokoaatbuffer (Applichem) vir 4 uur, en dan vir 2 uur gewas. Herhaal 3 keer met 0.1 M kokamiedbuffer. Vervolgens is die stygende reeks etanol gebruik om elke etanoloplossing vir 15 minute by 4°C te inkubeer om die weefsel te dehidreer. Die weefsel is oorgedra na propileenoksied en oornag in EPON (Sigma-Aldrich) by 4°C geïnkubeer. Plaas die weefsel vir 2 uur in vars EPON by kamertemperatuur en heg dit dan vir 72 uur by 62°C in. Gebruik 'n ultramikrotoom (Leica Microsystems, UC6) en 'n diamantmes (Diatome, Biel, Switserland) om 70 nm ultradun snitte te sny en kleur dit vir 15 minute by 37°C met 1.5% uranielasetaat en kleur dit vir 4 minute met 'n loodsitraatoplossing. Die elektronmikrograwe is geneem met behulp van 'n JEM-2100 Plus transmissie-elektronmikroskoop (JEOL) toegerus met Camera OneView 4K 16-bis (Gatan) en DigitalMicrograph sagteware (Gatan). Vir analise is elektronmikrograwe verkry met 5000× of 10 000× digitale zoom.
Morfologiese analise van mitochondria. Vir alle analises is die kontoere van individuele mitochondria handmatig in digitale beelde uiteengesit met behulp van ImageJ-sagteware. Verskillende morfologiese parameters word geanaliseer. Mitochondriale digtheid word uitgedruk as 'n persentasie wat verkry word deur die totale mitochondriale area van elke sel te deel deur die sitoplasma-area (sitoplasma-area = selarea-selkern-area) × 100. Die rondheid van mitochondria word bereken met die formule [4π∙(area/omtrek 2)]. Die ista-morfologie van mitochondria is geanaliseer en in twee kategorieë ("buisvormig" en "blaarvormig") verdeel volgens hul hoofvorms.
Analise van outofagosome/lisosoomgetal en digtheid. Gebruik ImageJ-sagteware om die kontoere van elke outofagosome/lisosoom handmatig in die digitale beeld te skets. Die outofagosome/lisosoomarea word uitgedruk as 'n persentasie wat bereken word deur die totale outofagosome/lisosoomstruktuurarea van elke sel te deel deur die sitoplasmaarea (sitoplasmaarea = selarea-kernarea) × 100. Die digtheid van outofagosome/lisosome word bereken deur die totale aantal te deel deur die aantal outofagosome/lisosoomstrukture per sel (in terme van sitoplasmiese area) (sitoplasmiese area = selarea-kernarea).
Etikettering vir akute snitte en monstervoorbereiding. Vir eksperimente wat glukose-etikettering vereis, dra die akute breinskyfies oor na 'n voor-inkubasiekamer, wat versadigde koolstof (95% O2 en 5% CO2), hoë Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriumfosfaatbuffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukose, 1.0 mM CaCl2 en 2.0 mM MgCl2, aangepas tot pH 7.4 en 310 tot 320 mOsm) bevat, waarin glukose 13C6-Glukose-vervanging is (Eurisotop, katalogusnommer CLM-1396). Vir eksperimente wat piruvaat-etikettering vereis, dra die akute breinskyfies oor na hoër Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriumfosfaatbuffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukose, 1.0 mM CaCl2 en voeg 2.0 mM MgCl2 by, pas aan tot pH 7.4 en 310 tot 320 mOsm), en voeg 1 mM 1-[1-13C]piruvaat (Eurisotop, katalogusnommer CLM-1082) by. Inkubeer die snitte vir 90 minute by 37°C. Aan die einde van die eksperiment is die snitte vinnig gewas met 'n waterige oplossing (pH 7.4) wat 75 mM ammoniumkarbonaat bevat, en dan gehomogeniseer in 40:40:20 (v:v:v) asetonitriel (ACN): metanol: water. Nadat die seksies vir 30 minute op ys geïnkubeer is, is die monsters vir 10 minute by 21 000 g by 4°C gesentrifugeer, en die helder supernatant is in 'n SpeedVac-konsentrator gedroog. Die gevolglike gedroogde metabolietpellet is by -80°C gestoor tot ontleding.
Vloeistofchromatografie-massaspektrometrie-analise van 13C-gemerkte aminosure. Vir vloeistofchromatografie-massaspektrometrie (LC-MS)-analise is die metabolietpellet in 75μl LC-MS-graadwater (Honeywell) hersuspendeer. Na sentrifugering by 21 000 g vir 5 minute by 4°C, is 20 μl van die geklaarde supernatant gebruik vir aminosuurvloeisanalise, terwyl die res van die ekstrak onmiddellik vir anioonanalise gebruik is (sien hieronder). Aminosuuranalise is uitgevoer met behulp van die voorheen beskryfde bensoïelchloried-derivatiseringsprotokol (55, 56). In die eerste stap is 10μl 100 mM natriumkarbonaat (Sigma-Aldrich) by 20μl metabolietekstrak gevoeg, en daarna is 10μl 2% bensoïelchloried (Sigma-Aldrich) by die LC-graad ACN gevoeg. Die monster is kortliks gevortex en toe vir 5 minute by 20°C teen 21 000 g gesentrifugeer. Plaas die geklaarde supernatant oor na 'n 2 ml outomatiseringsflessie met 'n koniese glasinsetsel (200 μl volume). Die monsters is geanaliseer met behulp van die Acquity iClass ultra-hoëprestasie LC-stelsel (Waters) wat gekoppel is aan die Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) hoë-resolusie presisie massaspektrometer (Thermo Fisher Scientific). Vir analise is 2μl van die gederivatiseerde monster in 'n 100×1.0 mm hoësterkte silika T3 kolom (Waters) ingespuit wat 1.8μm deeltjies bevat. Die vloeitempo is 100μl/min, en die bufferstelsel bestaan ​​uit buffer A (10 mM ammoniumformaat en 0.15% mieresuur in water) en buffer B (ACN). Die gradiënt is soos volg: 0%B na 0 minute; 0%B. 0 tot 15% B teen 0 tot 0.1 minute; 15 tot 17% B teen 0.1 tot 0.5 minute; B teen 17 tot 55% teen 0.5 tot 14 minute; B teen 55 tot 70% teen 14 tot 14.5 minute; teen 14.5 tot 70 tot 100% B teen 18 minute; 100% B teen 18 tot 19 minute; 100 tot 0% B teen 19 tot 19.1 minute; 0% B teen 19.1 tot 28 minute (55, 56). Die QE-HF massaspektrometer werk in positiewe ionisasiemodus met 'n massabereik van m/z (massa/ladingverhouding) van 50 tot 750. Die toegepaste resolusie is 60 000, en die verkrygde versterkingsbeheer (AGC) ioonteiken is 3 × 106, en die maksimum ioontyd is 100 millisekondes. Die verhitte elektrosproei-ionisasie (ESI) bron werk teen 'n spuitspanning van 3,5 kV, 'n kapillêre temperatuur van 250 °C, 'n skedelugvloei van 60 AU (arbitrêre eenhede) en 'n hulplugvloei van 20 AU tot 250 °C. Die S-lens is ingestel op 60 AU.
Anioonchromatografie-MS-analise van 13C-gemerkte organiese sure. Die oorblywende metabolietpresipitaat (55 μl) is geanaliseer met behulp van 'n Dionex-ioonchromatografiestelsel (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) gekoppel aan 'n QE-HF-massaspektrometer (Thermo Fisher Scientific). Kortliks, 5 μl metabolietekstrak is ingespuit in 'n Dionex IonPac AS11-HC-kolom toegerus met HPLC (2 mm × 250 mm, deeltjiegrootte 4 μm, Thermo Fisher Scientific) in indruk-gedeeltelike lusmodus met 'n vulverhouding van 1.) Dionex IonPac AG11-HC-beskermingskolom (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Die kolomtemperatuur word op 30 °C gehandhaaf, en die outomatiseerder word op 6 °C gestel. Gebruik 'n kaliumhidroksiedpatroon wat met gedeïoniseerde water voorsien word om 'n kaliumhidroksiedgradiënt deur die eluentgenerator te genereer. Skeiding van metaboliete teen 'n vloeitempo van 380 μl/min, met die toepassing van die volgende gradiënt: 0 tot 3 minute, 10 mM KOH; 3 tot 12 minute, 10 tot 50 mM KOH; 12 tot 19 minute, 50 tot 100 mM KOH; 19 tot 21 minute, 100 mM KOH; 21 tot 21.5 minute, 100 tot 10 mM KOH. Die kolom is vir 8.5 minute weer onder 10 mM KOH geëkwilibreer.
Die geëlueerde metaboliete word gekombineer met 'n 150 μl/min isopropanol-aanvullingstroom na die kolom en dan gerig na 'n hoë-resolusie massaspektrometer wat in negatiewe ionisasiemodus werk. MS monitor die massabereik van m/z 50 tot 750 met 'n resolusie van 60 000. Die AGC is ingestel op 1 × 106, en die maksimum ioontyd word op 100 ms gehou. Die verhitte ESI-bron is bedryf teen 'n spuitspanning van 3,5 kV. Die ander instellings van die ioonbron is soos volg: kapillêre temperatuur 275 °C; skedegasvloei, 60 AE; hulpgasvloei, 20 AE teen 300 °C, en S-lensinstelling op 60 AE.
Data-analise van 13C-gemerkte metaboliete. Gebruik TraceFinder-sagteware (weergawe 4.2, Thermo Fisher Scientific) vir data-analise van die isotoopverhouding. Die identiteit van elke verbinding is geverifieer deur 'n betroubare verwysingsverbinding en onafhanklik geanaliseer. Om isotoopverrykingsanalise uit te voer, is die area van die geëkstraheerde ioonchromatogram (XIC) van elke 13C-isotoop (Mn) geëkstraheer uit [M + H]+, waar n die koolstofgetal van die teikenverbinding is, wat gebruik word om aminosure te analiseer, of [MH]+ wat gebruik word om anione te analiseer. Die massa-akkuraatheid van XIC is minder as vyf dele per miljoen, en die akkuraatheid van RT is 0.05 minute. Die verrykingsanalise word uitgevoer deur die verhouding van elke opgespoorde isotoop tot die som van alle isotope van die ooreenstemmende verbinding te bereken. Hierdie verhoudings word as persentasiewaardes vir elke isotoop gegee, en die resultate word uitgedruk as molêre persentasie verryking (MPE), soos voorheen beskryf (42).
Die bevrore neuronpellet is gehomogeniseer in yskoue 80% metanol (v/v), gevortex en vir 30 minute by -20°C geïnkubeer. Vortex die monster weer en roer by +4°C vir 30 minute. Die monster is vir 5 minute by 21 000 g by 4°C gesentrifugeer, en toe is die gevolglike supernatant versamel en gedroog met behulp van 'n SpeedVac-konsentrator by 25°C vir daaropvolgende analise. Soos hierbo beskryf, is LC-MS-analise op die aminosure van die gesorteerde selle uitgevoer. Met behulp van TraceFinder (weergawe 4.2, Thermo Fisher Scientific) is data-analise uitgevoer met behulp van die monoisotopiese massa van elke verbinding. Kwantielnormalisering van metabolietdata is uitgevoer met behulp van die preprocessCore-sagtewarepakket (57).
Snyvoorbereiding. Die muis is vinnig met koolstofdioksied verdoof en onthoof, die brein is vinnig van die skedel verwyder, en die ysgevulde vibrerende mes (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Duitsland) is gebruik om dit in 300 tot 375 μm sagittale snitte te sny. Koue koolstofvergassingsmetode (95% O2 en 5% CO2) Lae Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriumfosfaatbuffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukose, 1.0 mM CaCl2 en 6.0 mM MgCl2. Pas aan tot pH 7.4 en 310 tot 330 mOsm). Plaas die verkrygde breinskyfies oor na 'n kamer wat hoër Ca2 + ACSF bevat (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriumfosfaatbuffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukose, 4.0 mM CaCl2 en mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 en 310 tot 320 mOsm). Bêre die skyfies vir 20 tot 30 minute sodat hulle herstel kan word voor opname.
opname. 'n Mikroskoopstadium toegerus met 'n vaste opnamekamer en 'n 20x wateronderdompelingsobjektieflens (Scientifica) is vir alle opnames gebruik. Die vermeende Purkinje-selle is geïdentifiseer deur (i) liggaamsgrootte, (ii) anatomiese ligging van die serebellum, en (iii) uitdrukking van die fluorescerende mtYFP-verslaggeen. Die lappipet met 'n puntweerstand van 5 tot 11 megohm word uitgetrek deur 'n borosilikaatglaskapillêr (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Duitsland) en 'n horisontale pipet Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Alle opnames is uitgevoer deur die ELC-03XS npi-lapklemversterker (npi electronic GmbH, Tam, Duitsland), wat beheer is deur die sagteware Signal (weergawe 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, VK). Die eksperiment is opgeneem teen 'n steekproeftempo van 12.5 kHz. Die sein word gefiltreer met twee kortdeurlaat-Bessel-filters met afsnyfrekwensies van onderskeidelik 1.3 en 10 kHz. Die kapasitansie van die membraan en die pipet word gekompenseer deur die kompensasiekring met behulp van die versterker. Alle eksperimente is uitgevoer onder die beheer van 'n Orca-Flash 4.0-kamera (Hamamatsu, Gerden, Duitsland), wat beheer is deur die Hokawo-sagteware (weergawe 2.8, Hamamatsu, Gerden, Duitsland).
Roetine heelselkonfigurasie en -analise. Vul die pipet onmiddellik voor opname met die interne oplossing wat die volgende stowwe bevat: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM kaliumglukonaat, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosientrifosfaat (GTP) (Na) en 10.0 mM kreatinienfosfaat is aangepas tot pH 7.25, en die osmotiese druk was 290 mOsm (sukrose). Onmiddellik na die toepassing van 'n krag van 0 pA om die membraan te breek, is die rusmembraanpotensiaal gemeet. Die insetweerstand word gemeet deur hipergepolariseerde strome van -40, -30, -20 en -10 pA toe te pas. Meet die grootte van die spanningsrespons en gebruik Ohm se wet om die insetweerstand te bereken. Spontane aktiwiteit is vir 5 minute in 'n spanningsklem aangeteken, en sPSC is geïdentifiseer en gemeet in Igor Pro (weergawe 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, VSA) met behulp van 'n semi-outomatiese herkenningsskript. Die IV-kromme en bestendige stroom word gemeet deur die battery by verskillende potensiale vas te klem (vanaf -110 mV) en die spanning in 5 mV-stappe te verhoog. Die produksie van AP is getoets deur 'n depolariserende stroom toe te pas. Klem die sel by -70 mV vas terwyl 'n depolariserende stroompuls toegepas word. Pas die stapgrootte van elke opname-eenheid afsonderlik aan (10 tot 60 pA). Bereken die maksimum AP-frekwensie deur die pulspieke wat die hoogste AP-frekwensie veroorsaak, handmatig te tel. Die AP-drempel word geanaliseer deur die tweede afgeleide van die depolarisasiepuls te gebruik wat eers een of meer AP's aktiveer.
Geperforeerde pleisterkonfigurasie en -analise. Voer geperforeerde pleisteropname uit met behulp van standaardprotokolle. Gebruik 'n ATP- en GTP-vrye pipet wat nie die volgende bestanddele bevat nie: 128 mM glukonaat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA en 2 mM MgCl2, en pas aan tot pH 7.2 (met behulp van KOH). ATP en GTP word uit die intrasellulêre oplossing weggelaat om onbeheerde deurlaatbaarheid van die selmembraan te voorkom. Die pleisterpipet word gevul met 'n amfoterisienbevattende interne oplossing (ongeveer 200 tot 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) om 'n geponste pleisteropname te verkry. Amfoterisien is opgelos in dimetielsulfoksied (finale konsentrasie: 0.1 tot 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Die konsentrasie DMSO wat gebruik is, het geen beduidende effek op die neurone wat bestudeer is, gehad nie. Tydens die ponsproses is die kanaalweerstand (Ra) voortdurend gemonitor, en die eksperiment is begin nadat die amplitude van Ra en AP gestabiliseer het (20-40 minute). Spontane aktiwiteit word vir 2 tot 5 minute in 'n spannings- en/of stroomklem gemeet. Data-analise is uitgevoer met behulp van Igor Pro (weergawe 7.05.2, WaveMetrics, VSA), Excel (weergawe 2010, Microsoft Corporation, Redmond, VSA) en GraphPad Prism (weergawe 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Verenigde State). Om spontane AP's te identifiseer, word IgorPro se NeuroMatic v3.0c-inprop gebruik. Identifiseer AP's outomaties met behulp van 'n gegewe drempelwaarde, wat individueel vir elke rekord aangepas word. Gebruik die piekinterval om die piekfrekwensie met die maksimum oombliklike piekfrekwensie en die gemiddelde piekfrekwensie te bepaal.
PN-isolasie. Deur aanpassing by die voorheen gepubliseerde protokol, is PN'e op 'n spesifieke stadium uit die muiskerebellum gesuiwer (58). Kortliks, die serebellum is gedissekteer en fyngemaak in yskoue dissosiasiemedium [sonder HBSS Ca2+ en Mg2+, aangevul met 20 mM glukose, penisillien (50 U/ml) en streptomisien (0.05 mg/ml)], en dan is die medium in papaïen verteer [HBSS, aangevul met 1-sisteïen·HCl (1 mg/ml), papaïen (16 U/ml) en deoksiribonuklease I (DNase I; 0.1 mg/ml)]. Behandel vir 30 minute by 30°C. Was eers die weefsels in HBSS-medium wat eiermukus (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) en DNase (0.1 mg/ml) bevat by kamertemperatuur om ensiematiese vertering te voorkom, en dan in die HBSS-medium wat 20 mM glukose bevat. Maal HBSS, penisillien (50 U/ml), streptomisien (0.05 mg/ml) en DNase (0.1 mg/ml) liggies in. Die gevolglike selsuspensie is deur 'n 70μm selsif gefiltreer, dan is die selle deur sentrifugering (1110 rpm, 5 minute, 4°C) gepelleteer en in sorteermedium [HBSS, aangevul met 20 mM glukose, 20% fetale beeserum, penisillien (50 U/ml) en streptomisien (0.05 mg/ml)] hersuspendeer; evalueer sel-lewensvatbaarheid met propidiumjodied en pas die seldigtheid aan op 1×106 tot 2×106 selle/ml. Voor vloeisitometrie is die suspensie deur 'n 50 μm selsif gefiltreer.
Vloeisitometer. Selsortering is uitgevoer by 4°C met behulp van die FACSAria III-masjien (BD Biosciences) en FACSDiva-sagteware (BD Biosciences, weergawe 8.0.1). Die selsuspensie is gesorteer met behulp van 'n 100 μm-spuitstuk onder 'n druk van 20 psi teen 'n tempo van ~2800 gebeurtenisse/sek. Aangesien tradisionele poortkriteria (selgrootte, bimodale diskriminasie en verstrooiingseienskappe) nie die korrekte isolasie van PN van ander seltipes kan verseker nie, word die poortstrategie gestel op grond van die direkte vergelyking van die YFP-intensiteit en outofluoresensie in mitoYFP+ ​​​​en die kontrole mitoYFP − Muise. YFP word opgewek deur die monster met 'n 488 nm laserlyn te bestraal, en die sein word opgespoor met behulp van 'n 530/30 nm banddeurlaatfilter. In mitoYFP+ ​​​​muise word die relatiewe sterkte van die Rosa26-mitoYFP-verslaggeen ook gebruik om neuronale liggaams- en aksonfragmente te onderskei. 7-AAD word opgewek met 'n 561 nm geel laser en opgespoor met 'n 675/20 nm banddeurlaatfilter om dooie selle uit te sluit. Om astrosiete terselfdertyd te skei, is die selsuspensie gekleur met ACSA-2-APC, daarna is die monster bestraal met 'n 640 nm laserlyn, en 'n 660/20 nm banddeurlaatfilter is gebruik om die sein op te spoor.
Die versamelde selle is deur sentrifugering (1110 rpm, 5 minute, 4°C) gepelleteer en by -80°C gestoor tot gebruik. Mfn2cKO-muise en hul werpselwelpies word op dieselfde dag geklassifiseer om prosedurele variasie te verminder. FACS-data-aanbieding en -analise is uitgevoer met behulp van FlowJo-sagteware (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, VSA).
Soos hierbo genoem (59), word intydse PCR gebruik om DNS van die gesorteerde neurone te isoleer vir daaropvolgende mtDNS-kwantifisering. Die lineariteit en drempelgevoeligheid is aanvanklik getoets deur qPCR op verskillende getalle selle uit te voer. Kortliks, versamel 300 PN in 'n lisebuffer bestaande uit 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 en proteinase K (200 ng/ml) en inkubeer by 55°C vir 120 minute. Die selle is verder by 95°C vir 10 minute geïnkubeer om volledige inaktivering van proteinase K te verseker. Met behulp van 'n TaqMan-probe (Thermo Fisher) spesifiek vir mt-Nd1, is mtDNS gemeet deur semi-kwantitatiewe PCR in die 7900HT Real-Time PCR-stelsel (Thermo Fisher Scientific). Science, katalogusnommer Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, katalogusnommer AIVI3E8) en 18S (Thermo Fisher Scientific, katalogusnommer Hs99999901_s1) gene.
Proteoommonstervoorbereiding. Deur die oplossing vir 10 minute by 95°C te verhit en te sonikeer, in die lisebuffer [6 M guanidienchloried, 10 mM tris(2-karboksietiel)fosfienhidrochloried, 10 mM chloorasetamied en 100 mM tris-Lise bevrore neuronpellets in HCl]. Op Bioruptor (Diagenode) vir 10 minute (30 sekondes puls / 30 sekondes pouseperiode). Die monster is 1:10 verdun in 20 mM tris-HCl (pH 8.0), gemeng met 300 ng tripsin goud (Promega), en oornag by 37°C geïnkubeer om volledige vertering te verkry. Op die tweede dag is die monster vir 20 minute by 20 000 g gesentrifugeer. Die supernatant is verdun met 0.1% mieresuur, en die oplossing is ontsout met selfgemaakte StageTips. Die monster is in 'n SpeedVac-instrument (Eppendorf-konsentrator plus 5305) by 45°C gedroog, en toe is die peptied in 0.1% mieresuur gesuspendeer. Alle monsters is gelyktydig deur dieselfde persoon voorberei. Om astrosietmonsters te analiseer, is 4 μg ontsoute peptiede gemerk met 'n tandem-massa-etiket (TMT10plex, katalogusnommer 90110, Thermo Fisher Scientific) met 'n peptied-tot-TMT-reagens-verhouding van 1:20. Vir TMT-etikettering is 0.8 mg TMT-reagens in 70 μl anhidriese ACN hersuspendeer, en die gedroogde peptied is herkonstitueer in 9 μl 0.1 M TEAB (triëtielammoniumbikarbonaat), waaraan 7 μl TMT-reagens in ACN bygevoeg is. Die konsentrasie was 43.75%. Na 60 minute se inkubasie is die reaksie geblus met 2 μl 5% hidroksielamien. Die gemerkte peptiede is versamel, gedroog, hersuspendeer in 200 μl 0.1% mieresuur (VS), in twee verdeel en toe ontsout met behulp van selfgemaakte StageTips. Met behulp van 'n UltiMate 3000 ultra hoëprestasievloeistofchromatograaf (UltiMate 3000 ultra hoëprestasievloeistofchromatograaf), is een van die twee helftes gefraksioneer op 'n 1 mm x 150 mm Acquity chromatografiese kolom gevul met 130 Å1.7 μm C18-deeltjies (Waters, katalogusnr. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Skei peptiede teen 'n vloeitempo van 30 μl/min, skei van 1% tot 50% buffer B vir 85 minute met 'n stapsgewyse gradiënt van 96 minute, van 50% tot 95% buffer B vir 3 minute, dan 8 minute vir 95% Buffer B; Buffer A is 5% ACN en 10 mM ammoniumbikarbonaat (ABC), en buffer B is 80% ACN en 10 mM ABC. Versamel fraksies elke 3 minute en kombineer hulle in twee groepe (1 + 17, 2 + 18, ens.) en droog hulle in 'n vakuumsentrifuge.
LC-MS/MS-analise. Vir massaspektrometrie is die peptiede (nommer r119.aq) geskei op 'n 25 cm, 75 μm binnediameter PicoFrit analitiese kolom (nuwe objektieflens, onderdeelnommer PF7508250) toegerus met 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Dr. Maisch, mat), Gebruik EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Duitsland). Die kolom is by 50°C gehou. Buffers A en B is onderskeidelik 0.1% mieresuur in water en 0.1% mieresuur in 80% ACN. Peptiede is vir 65 minute van 6% tot 31% buffer B en vir 5 minute van 31% tot 50% buffer B geskei met 'n gradiënt van 200 nl/min. Die geëlueerde peptiede is op 'n Orbitrap Fusion massaspektrometer (Thermo Fisher Scientific) geanaliseer. Peptiedvoorloper m/z-meting word uitgevoer met 'n resolusie van 120 000 in die reeks van 350 tot 1500 m/z. Deur 27% genormaliseerde botsingsenergie te gebruik, word die sterkste voorloper met 'n ladingstoestand van 2 tot 6 gekies vir hoë-energie C-val-dissosiasie (HCD)-splitsing. Die siklustyd word op 1 s gestel. Die m/z-waarde van die peptiedfragment is in die ioonval gemeet met behulp van die kleinste AGC-teiken van 5 × 104 en die maksimum inspuittyd van 86 ms. Na fragmentering is die voorloper vir 45 s op die dinamiese uitsluitingslys geplaas. TMT-gemerkte peptiede is geskei op 'n 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap-kolom (Thermo Fisher Scientific, katalogusnommer 164942), en die migrasiespektra is geanaliseer op 'n Orbitrap Lumos Tribrid-massaspektrometer (Thermo Fisher Scientific) toegerus met hoëveld-asimmetriese golfvormione (FAIMS)-toerusting (Thermo Fisher Scientific) wat werk teen twee kompensasiespannings van −50 en −70 V. MS3 wat gekies is op grond van die sinchronisasie-voorloper word gebruik vir TMT-verslagioonseinmeting. Die peptiedskeiding is uitgevoer op EASY-nLC 1200, met behulp van 'n 90% lineêre gradiëntelusie, met 'n bufferkonsentrasie van 6% tot 31%; buffer A was 0.1% FA, en buffer B was 0.1% FA en 80% ACN. Die analitiese kolom word teen 50°C bedryf. Gebruik FreeStyle (weergawe 1.6, Thermo Fisher Scientific) om die oorspronklike lêer te verdeel volgens die FAIMS-kompensasiespanning.
Proteïenidentifikasie en -kwantifisering. Deur die geïntegreerde Andromeda-soekenjin te gebruik, is die oorspronklike data geanaliseer met behulp van MaxQuant weergawe 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Benewens die Cre-rekombinase- en YFP-volgordes verkry van Aequorea victoria, is peptiedfragmentspektra deursoek vir die kanonieke volgorde en isovormvolgorde van die muisverwysingsproteoom (Proteoom-ID UP000000589, afgelaai van UniProt in Mei 2017). Metionienoksidasie en proteïen N-terminale asetilering is as veranderlike modifikasies gestel; sisteïenkarbamoïelmetilering is as vaste modifikasies gestel. Die verteringsparameters is gestel op "spesifisiteit" en "tripsin/P". Die minimum aantal peptiede en skeermes-peptiede wat vir proteïenidentifikasie gebruik word, is 1; die minimum aantal unieke peptiede is 0. Onder die toestande van peptiedkaartooreenstemming was die proteïenidentifikasietempo 0.01. Die "Tweede Peptied"-opsie is geaktiveer. Gebruik die "ooreenstemming tussen lopies"-opsie om suksesvolle identifikasies tussen verskillende oorspronklike lêers oor te dra. Gebruik LFQ minimum verhouding telling 1 vir etiketvrye kwantifisering (LFQ) (60). Die LFQ-intensiteit word gefiltreer vir ten minste twee geldige waardes in ten minste een genotipegroep by elke tydpunt, en word geëkstrapoleer vanaf 'n normale verspreiding met 'n breedte van 0.0.3 en beweeg af 1.8. Gebruik die Perseus-rekenaarplatform (https://maxquant.net/perseus/) en R (https://r-project.org/) om die LFQ-resultate te analiseer. 'n Tweerigting-matige t-toets van die limma-sagtewarepakket is gebruik vir differensiële ekspressie-analise (61). Verkennende data-analise word uitgevoer met behulp van ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally en pheatmap. Die TMT-gebaseerde proteomika-data is geanaliseer met behulp van MaxQuant weergawe 1.6.10.43. Soek vir rou proteomika-data vanaf UniProt se menslike proteomika-databasis, wat in September 2018 afgelaai is. Die analise sluit die isotoop-suiwerheidskorreksiefaktor in wat deur die vervaardiger verskaf word. Gebruik limma in R vir differensiële ekspressie-analise. Die oorspronklike data, databasis-soekresultate en data-analise-werkvloei en -resultate word almal in die ProteomeXchange-alliansie gestoor deur die PRIDE-vennootbewaarplek met die datastel-identifiseerder PXD019690.
Funksionele annotasies verryk die analise. Die Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) instrument is gebruik om die rykdom van die funksionele annotasieterme van die datastel na 8 weke te bepaal (Figuur 1). Kortliks, die kwantitatiewe proteïenlys wat verkry is uit LC-MS/MS (tandem massaspektrometrie) data-analise word gebruik met die volgende filterkriteria: Mus musculus word gekies as die spesie en agtergrond, en die kategorie toon die P-waarde wat deur Benjamini aangepas is vir verryking 0.05 of laer word as beduidend beskou. Vir hierdie grafiek word die top vyf oortollige kategorieë in elke groep gebaseer op die aangepaste P-waarde getoon. Deur gebruik te maak van veelvuldige t-toetse, met behulp van die tweestadium lineêre hupstootprogram van Benjamini, Krieger en Yekutieli (Q = 5%), word tydverloop proteïenekspressie-analise uitgevoer op die belangrike kandidate wat in elke kategorie geïdentifiseer is, en elke ry word afsonderlik geanaliseer. Daar is geen nodigheid om 'n konsekwente SD aan te neem nie.
Om die resultate van hierdie studie met gepubliseerde databasisse te vergelyk en 'n Venn-diagram in Figuur 1 te genereer, het ons die kwantitatiewe proteïenlys gekombineer met MitoCarta 2.0-annotasies (24). Gebruik die aanlyn-instrument Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) om die diagram te genereer.
Vir meer inligting oor die statistiese prosedures wat vir proteomika-analise gebruik word, verwys asseblief na die ooreenstemmende afdeling van Materiale en Metodes. Vir alle ander eksperimente kan meer inligting in die ooreenstemmende legende gevind word. Tensy anders vermeld, word alle data uitgedruk as gemiddeld ± SEM, en alle statistiese ontledings is uitgevoer met behulp van GraphPad Prism 8.1.2 sagteware.
Vir aanvullende materiaal vir hierdie artikel, sien asseblief http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Hierdie is 'n ooptoegangartikel wat versprei word onder die bepalings van die Creative Commons Attribution-Nie-Kommersiële Lisensie, wat die gebruik, verspreiding en reproduksie in enige medium toelaat, solank die finale gebruik nie vir kommersiële gewin is nie en die uitgangspunt is dat die oorspronklike werk korrek is. Verwysing.
Let wel: Ons vra jou slegs om jou e-posadres te verskaf sodat die persoon wat jy aanbeveel vir die bladsy weet dat jy wil hê hulle moet die e-pos sien en dat dit nie strooipos is nie. Ons sal geen e-posadresse vasvang nie.
Hierdie vraag word gebruik om te toets of jy 'n besoeker is en om outomatiese strooipos-indiening te voorkom.
Deur E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomika-analise van disfunksionele neurone het aan die lig gebring dat metaboliese programme geaktiveer word om neurodegenerasie teen te werk.
Deur E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomika-analise van disfunksionele neurone het aan die lig gebring dat metaboliese programme geaktiveer word om neurodegenerasie teen te werk.
©2020 American Association for the Advancement of Science. alle regte voorbehou. AAAS is 'n vennoot van HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.