Dankie dat u Nature.com besoek het. Die weergawe van die blaaier wat u gebruik, het beperkte CSS-ondersteuning. Vir die beste resultate beveel ons aan dat u 'n nuwer weergawe van u blaaier gebruik (of Verenigbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer). Intussen, om voortgesette ondersteuning te verseker, wys ons die webwerf sonder stilering of JavaScript.
Propionsuur (PPA) word gebruik om die rol van mitochondriale disfunksie in neuro-ontwikkelingsversteurings soos outismespektrumversteuring te bestudeer. PPA is bekend daarvoor dat dit mitochondriale biogenese, metabolisme en omset ontwrig. Die effekte van PPA op mitochondriale dinamika, splitsing en fusie bly egter problematies as gevolg van die komplekse temporale aard van hierdie meganismes. Hier gebruik ons ​​komplementêre kwantitatiewe beeldtegnieke om te ondersoek hoe PPA mitochondriale ultrastruktuur, morfologie en dinamika in neuronagtige SH-SY5Y-selle beïnvloed. PPA (5 mM) het 'n beduidende afname in mitochondriale area (p < 0.01), fretdiameter en -omtrek (p < 0.05), en area 2 (p < 0.01) veroorsaak. Mitochondriale gebeurtenislokatoranalise het 'n beduidende toename (p < 0.05) in splitsing- en fusiegebeure getoon, waardeur die integriteit van die mitochondriale netwerk onder strestoestande gehandhaaf word. Daarbenewens was die mRNA-uitdrukking van cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) en OPA1 (p < 0.05) aansienlik verminder. 01). Dit illustreer die hermodellering van mitochondriale morfologie, biogenese en dinamika om funksie onder strestoestande te handhaaf. Ons data bied nuwe insig in die effekte van PPA op mitochondriale dinamika en beklemtoon die nut van beeldtegnieke vir die bestudering van die komplekse regulatoriese meganismes betrokke by mitochondriale stresresponse.
Mitochondria is integrale deelnemers aan 'n verskeidenheid sellulêre funksies benewens hul tipiese rolle in energieproduksie en biosintese. Mitochondriale metabolisme is 'n sleutelreguleerder van kalsiumseintransduksie, metaboliese en redoks homeostase, inflammatoriese seintransduksie, epigenetiese modifikasies, selproliferasie, differensiasie en geprogrammeerde seldood1. In die besonder is mitochondriale metabolisme krities vir neuronale ontwikkeling, oorlewing en funksie en word wyd geïmpliseer in verskeie manifestasies van neuropatologie2,3,4.
Oor die afgelope dekade het metaboliese status na vore gekom as 'n sentrale reguleerder van neurogenese, differensiasie, volwassenheid en plastisiteit5,6. Onlangs het mitochondriale morfologie en dinamika besonder belangrike komponente van mitose geword, 'n dinamiese proses wat 'n poel van gesonde mitochondria binne selle handhaaf. Mitochondriale dinamika word gereguleer deur komplekse interafhanklike weë wat wissel van mitochondriale biogenese en bio-energetika tot mitochondriale splitsing, fusie, vervoer en klaring7,8. Ontwrigting van enige van hierdie integrerende meganismes benadeel die instandhouding van gesonde mitochondriale netwerke en het diepgaande funksionele gevolge vir neuro-ontwikkeling9,10. Inderdaad, disregulering van mitochondriale dinamika word waargeneem in baie psigiatriese, neurodegeneratiewe en neuro-ontwikkelingsversteurings, insluitend outismespektrumversteurings (OSV)11,12.
ASS is 'n heterogene neuro-ontwikkelingsversteuring met 'n komplekse genetiese en epigenetiese argitektuur. Die oorerflikheid van ASS is onbetwis, maar die onderliggende molekulêre etiologie bly swak verstaan. Die versameling van data uit prekliniese modelle, kliniese studies en multi-omika molekulêre datastelle lewer toenemende bewyse van mitochondriale disfunksie in ASS13,14. Ons het voorheen 'n genoomwye DNS-metileringsifting in 'n kohort pasiënte met ASS uitgevoer en differensieel gemetileerde gene geïdentifiseer wat langs mitochondriale metaboliese weë gegroepeer is15. Ons het vervolgens differensiële metilering van sentrale reguleerders van mitochondriale biogenese en dinamika gerapporteer, wat geassosieer is met 'n verhoogde mtDNS-kopienommer en veranderde urienmetaboliese profiel in ASS16. Ons data lewer toenemende bewyse dat mitochondriale dinamika en homeostase 'n sentrale rol speel in die patofisiologie van ASS. Daarom is die verbetering van die meganistiese begrip van die verhouding tussen mitochondriale dinamika, morfologie en funksie 'n sleuteldoelwit van voortgesette navorsing oor neurologiese siektes wat gekenmerk word deur sekondêre mitochondriale disfunksie.
Molekulêre tegnieke word dikwels gebruik om die rol van spesifieke gene in mitochondriale stresresponse te bestudeer. Hierdie benadering kan egter beperk word deur die veelsydige en temporale aard van mitotiese beheermeganismes. Boonop is differensiële uitdrukking van mitochondriale gene 'n indirekte aanduiding van funksionele veranderinge, veral omdat slegs 'n beperkte aantal gene tipies geanaliseer word. Daarom is meer direkte metodes vir die bestudering van mitochondriale funksie en bio-energetika voorgestel17. Mitochondriale morfologie is nou verwant aan mitochondriale dinamika. Mitochondriale vorm, konnektiwiteit en struktuur is krities vir energieproduksie en mitochondriale en seloorlewing5,18. Boonop fokus die verskillende komponente van mitose op veranderinge in mitochondriale morfologie, wat as nuttige eindpunte van mitochondriale disfunksie kan dien en 'n basis kan bied vir daaropvolgende meganistiese studies.
Mitochondriale morfologie kan direk waargeneem word deur transmissie-elektronmikroskopie (TEM) te gebruik, wat 'n gedetailleerde studie van sellulêre ultrastruktuur moontlik maak. TEM visualiseer direk die morfologie, vorm en struktuur van mitochondriale cristae by die resolusie van individuele mitochondria, eerder as om slegs op geentranskripsie, proteïenuitdrukking of mitochondriale funksionele parameters in selpopulasies staat te maak17,19,20. Daarbenewens fasiliteer TEM die studie van interaksies tussen mitochondria en ander organelle, soos die endoplasmiese retikulum en outofagosome, wat sleutelrolle speel in mitochondriale funksie en homeostase21,22. Dit maak TEM dus 'n goeie beginpunt vir die bestudering van mitochondriale disfunksie voordat daar op spesifieke bane of gene gefokus word. Namate mitochondriale funksie toenemend relevant word vir neuropatologie, is daar 'n duidelike behoefte om mitochondriale morfologie en dinamika direk en kwantitatief in in vitro neuronale modelle te kan bestudeer.
In hierdie artikel ondersoek ons ​​mitochondriale dinamika in 'n neuronale model van mitochondriale disfunksie in outismespektrumversteuring. Ons het voorheen differensiële metilering van propioniel-CoA karboksilase beta (PCCB) in ASD15, 'n subeenheid van die mitochondriale propioniel-CoA karboksilase ensiem PCC, gerapporteer. Disregulering van PCC is bekend daarvoor dat dit toksiese ophoping van propionielderivate, insluitend propioonsuur (PPA) veroorsaak23,24,25. Daar is getoon dat PPA neuronale metabolisme ontwrig en gedrag in vivo verander en is 'n gevestigde diermodel vir die bestudering van neuro-ontwikkelingsmeganismes wat betrokke is by ASD26,27,28. Daarbenewens is berig dat PPA mitochondriale membraanpotensiaal, biogenese en respirasie in vitro ontwrig en is dit wyd gebruik om mitochondriale disfunksie in neurone te modelleer29,30. Die impak van PPA-geïnduseerde mitochondriale disfunksie op mitochondriale morfologie en dinamika bly egter swak verstaan.
Hierdie studie gebruik komplementêre beeldtegnieke om die effekte van PPA op mitochondriale morfologie, dinamika en funksie in SH-SY5Y-selle te kwantifiseer. Eerstens het ons 'n TEM-metode ontwikkel om veranderinge in mitochondriale morfologie en ultrastruktuur te visualiseer17,31,32. Gegewe die dinamiese aard van mitochondria33, het ons ook mitochondriale gebeurtenislokaliseerder (MEL) analise gebruik om veranderinge in die balans tussen fisie- en fusiegebeure, mitochondriale aantal en volume onder PPA-stres te kwantifiseer. Laastens het ons ondersoek of mitochondriale morfologie en dinamika geassosieer word met veranderinge in die uitdrukking van gene wat betrokke is by biogenese, fisie en fusie. Saamgevat illustreer ons data die uitdaging om die kompleksiteit van die meganismes wat mitochondriale dinamika reguleer, te verduidelik. Ons beklemtoon die nut van TEM in die bestudering van mitochondriale morfologie as 'n meetbare konvergente eindpunt van mitose in SH-SY5Y-selle. Daarbenewens beklemtoon ons dat TEM-data die rykste inligting verskaf wanneer dit gekombineer word met beeldtegnieke wat ook dinamiese gebeurtenisse in reaksie op metaboliese stres vasvang. Verdere karakterisering van die molekulêre regulatoriese meganismes wat neuronale selmitose ondersteun, kan belangrike insig bied in die mitochondriale komponent van die senuweestelsel en neurodegeneratiewe siektes.
Om mitochondriale stres te veroorsaak, is SH-SY5Y-selle behandel met PPA met 3 mM en 5 mM natriumpropionaat (NaP). Voor TEM is monsters onderwerp aan kriogeniese monstervoorbereiding deur hoëdrukvriesing en -vriesing (Fig. 1a). Ons het 'n outomatiese mitochondriale beeldanalisepyplyn ontwikkel om agt morfologiese parameters van mitochondriale populasies oor drie biologiese replikate te meet. Ons het gevind dat PPA-behandeling vier parameters beduidend verander het: area 2, area, omtrek en Feret-deursnee (Fig. 1b-e). Area 2 het beduidend afgeneem met beide 3 mM en 5 mM PPA-behandeling (p = 0.0183 en p = 0.002, onderskeidelik) (Fig. 1b), terwyl area (p = 0.003), omtrek (p = 0.0106) en Feret-deursnee almal beduidend afgeneem het. Daar was 'n beduidende vermindering (p = 0.0172) in die 5 mM-behandelingsgroep in vergelyking met die kontrolegroep (Fig. 1c-e). Beduidende verminderings in area en omtrek het getoon dat selle wat met 5 mM PPA behandel is, kleiner, meer afgeronde mitochondria gehad het, en dat hierdie mitochondria minder verleng was as dié in kontroleselle. Dit stem ook ooreen met 'n beduidende afname in die Feret-deursnee, 'n onafhanklike parameter wat 'n afname in die grootste afstand tussen deeltjierande aandui. Veranderinge in die ultrastruktuur van die cristae is waargeneem: die cristae het minder prominent geword onder die invloed van PPA-stres (Fig. 1a, paneel B). Nie alle beelde het egter die ultrastruktuur van die cristae duidelik weerspieël nie, dus is 'n kwantitatiewe analise van hierdie veranderinge nie uitgevoer nie. Hierdie TEM-data kan drie moontlike scenario's weerspieël: (1) PPA versterk splitsing of inhibeer fusie, wat veroorsaak dat bestaande mitochondria in grootte krimp; (2) verbeterde biogenese skep nuwe, kleiner mitochondria of (3) induseer beide meganismes gelyktydig. Alhoewel hierdie toestande nie deur TEM onderskei kan word nie, dui beduidende morfologiese veranderinge op veranderinge in mitochondriale homeostase en dinamika onder PPA-stres. Ons het vervolgens bykomende parameters ondersoek om hierdie dinamika en die potensiële meganismes onderliggend daaraan verder te karakteriseer.
Propioonsuur (PPA) hermodelleer mitochondriale morfologie. (a) Verteenwoordigende transmissie-elektronmikroskopie (TEM) beelde wat toon dat mitochondriale grootte afneem en mitochondria kleiner en meer afgerond word met toenemende PPA-behandeling; 0 mM (onbehandeld), 3 mM en 5 mM, onderskeidelik. Rooi pyle dui mitochondria aan. (b-e) SH-SY5Y-selle wat vir 24 uur met PPA behandel is, is voorberei vir TEM en die resultate is geanaliseer met behulp van Fiji/ImageJ. Vier van die agt parameters het beduidende verskille getoon tussen kontrole- (onbehandeld, 0 mM PPA) en behandelde (3 mM en 5 mM PPA) selle. (b) Streek 2, (c) Oppervlakte, (d) Omtrek, (e) Fret-deursnee. Eenrigting-variansie-analise (kontrole teenoor behandeling) en Dunnett se meervoudige vergelykingstoets is gebruik om beduidende verskille te bepaal (p < 0.05). Datapunte verteenwoordig die gemiddelde mitochondriale waarde vir elke individuele sel, en foutbalke verteenwoordig die gemiddelde ± SEM. Data wat getoon word, verteenwoordig n = 3, ten minste 24 selle per replikaat; 'n totaal van 266 beelde is geanaliseer; * dui p < 0.05 aan, ** dui p < 0.01 aan.
Om verder te karakteriseer hoe mitochondriale dinamika op PPA reageer, het ons mitochondria met tetrametielrodamienetielester (TMRE) gekleur en tydverloopmikroskopie en MEL-analise gebruik om mitochondria na 24 uur by 3 en 5 mM PPA te lokaliseer en te kwantifiseer. Behandeling van fisie- en fusiegebeure. (Fig. 2a). Na MEL-analise is mitochondria verder geanaliseer om die aantal mitochondriale strukture en hul gemiddelde volume te kwantifiseer. Ons het 'n klein maar beduidende toename in die aantal fisiegebeure wat by 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] plaasgevind het, waargeneem in vergelyking met fisie [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] en fusie [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] en fusie [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] gebeurtenisse was beduidend verhoog by 5 mM in vergelyking met die kontrole (Fig. 3b). Die aantal mitochondria het beduidend toegeneem by beide 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] en 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (Fig. 3c), terwyl die gemiddelde volume van elke mitochondriale struktuur onveranderd gebly het (Fig. 3c). 3d). Saamgevat dui dit daarop dat die hermodellering van mitochondriale dinamika dien as 'n kompenserende reaksie wat die integriteit van die mitochondriale netwerk suksesvol handhaaf. Die toename in die aantal fisiegebeurtenisse by 3 mM PPA dui daarop dat die toename in mitochondriale aantal deels te wyte is aan mitochondriale fisie, maar aangesien die gemiddelde mitochondriale volume wesenlik onveranderd bly, kan biogenese nie as 'n addisionele kompenserende reaksie uitgesluit word nie. Hierdie data stem egter ooreen met die kleiner, ronde mitochondriale strukture wat deur TEM waargeneem word en toon ook beduidende veranderinge in mitochondriale dinamika wat deur PPA veroorsaak word.
Propionsuur (PPA) veroorsaak dinamiese mitochondriale hermodellering om netwerkintegriteit te handhaaf. SH-SY5Y-selle is gekweek, behandel met 3 en 5 mM PPA vir 24 uur en gekleur met TMRE en Hoechst 33342, gevolg deur MEL-analise. (a) Verteenwoordigende tydverloopmikroskopiebeelde wat kleur en gebinariseerde maksimum intensiteitsprojeksies op tyd 2 (t2) vir elke toestand uitbeeld. Geselekteerde streke wat in elke binêre beeld aangedui word, word versterk en in 3D vertoon op drie verskillende tydraamwerke (t1-t3) om die dinamika oor tyd te illustreer; fusiegebeurtenisse word in groen uitgelig; fisiegebeurtenisse word in groen uitgelig. Vertoon in rooi. (b) Gemiddelde aantal dinamiese gebeurtenisse per toestand. (c) Gemiddelde aantal mitochondriale strukture per sel. (d) Gemiddelde volume (µm3) van elke mitochondriale struktuur per sel. Data wat getoon word, is verteenwoordigend van n = 15 selle per behandelingsgroep. Foutbalke wat getoon word, verteenwoordig gemiddelde ± SEM, skaalbalk = 10 μm, * p < 0.05.
Propionsuur (PPA) veroorsaak transkripsie-onderdrukking van gene wat met mitochondriale dinamika geassosieer word. SH-SY5Y-selle is vir 24 uur met 3 en 5 mM PPA behandel. Relatiewe geenkwantifisering is uitgevoer met behulp van RT-qPCR en genormaliseer na B2M. Mitochondriale biogenese-gene (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 en (d) NFE2L2. Mitochondriale fusie- en fisie-gene (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 en (i) DRP1. Beduidende verskille (p < 0.05) is getoets met behulp van eenrigting-ANOVA (kontrole teenoor behandeling) en Dunnett se meervoudige vergelykingstoets: * dui p < 0.05 aan, ** dui p < 0.01 aan, en **** dui p < 0.0001 aan. Stawe verteenwoordig gemiddelde uitdrukking ± SEM. Die getoonde data verteenwoordig n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), en n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) biologiese replikate.
Data van TEM- en MEL-ontledings saam dui daarop dat PPA mitochondriale morfologie en dinamika verander. Hierdie beeldtegnieke bied egter nie insig in die onderliggende meganismes wat hierdie prosesse dryf nie. Ons het dus die mRNA-uitdrukking van nege sleutelreguleerders van mitochondriale dinamika, biogenese en mitose in reaksie op PPA-behandeling ondersoek. Ons het selmyeloom-onkogeen (cMYC), kernrespiratoriese faktor (NRF1), mitochondriale transkripsiefaktor 1 (TFAM), NFE2-agtige transkripsiefaktor BZIP (NFE2L2), gastrien-agtige proteïen 2 (STOML2), optiese senuwee-atrofie 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) en dinamien-verwante proteïen 1 (DRP1) gekwantifiseer na 24 uur se behandeling met 3 mM en 5 mM PPA. Ons het 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 en p < 0.0001, onderskeidelik) en 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) PPA-behandeling waargeneem. (Fig. 3a–c). Die afname in mRNA-ekspressie was dosisafhanklik: die uitdrukking van cMYC, NRF1 en TFAM het onderskeidelik met 5.7, 2.6 en 1.9 keer afgeneem by 3 mM, en met 11.2, 3 en 2.2 keer by 5 mM. In teenstelling hiermee is die sentrale redoksbiogenese-geen NFE2L2 nie by enige konsentrasie PPA verander nie, alhoewel 'n soortgelyke dosisafhanklike tendens van afname in uitdrukking waargeneem is (Fig. 3d).
Ons het ook die uitdrukking van klassieke gene wat betrokke is by die regulering van fisie en fusie ondersoek. Daar word vermoed dat STOML2 betrokke is by fusie, mitofagie en biogenese, en die uitdrukking daarvan is beduidend verminder (p < 0.0001) met 3 mM (2.4-voudige verandering) en 5 mM (2.8-voudige verandering) PPA (Fig. 1). 3d). Net so is OPA1-fusiegeenuitdrukking verminder by 3 mM (1.6-voudige verandering) en 5 mM (1.9-voudige verandering) PPA (p = 0.006 en p = 0.0024, onderskeidelik) (Fig. 3f). Ons het egter geen beduidende verskille in die uitdrukking van fusiegene MFN1, MFN2 of fisiegeen DRP1 onder 24-uur PPA-stres gevind nie (Fig. 3g-i). Daarbenewens het ons gevind dat die vlakke van vier fusie- en splitsingsproteïene (OPA1, MFN1, MFN2 en DRP1) nie onder dieselfde toestande verander het nie (Fig. 4a-d). Dit is belangrik om daarop te let dat hierdie data 'n enkele tydstip weerspieël en moontlik nie veranderinge in proteïenuitdrukking of aktiwiteitsvlakke gedurende die vroeë stadiums van PPA-stres weerspieël nie. Beduidende verminderings in die uitdrukking van cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 en OPA1 dui egter op beduidende transkripsie-disregulering van mitochondriale metabolisme, biogenese en dinamika. Daarbenewens beklemtoon hierdie data die nut van beeldtegnieke om eindtoestandveranderinge in mitochondriale funksie direk te bestudeer.
Fusie- en fisiefaktorproteïenvlakke het nie verander na propioonsuur (PPA) behandeling nie. SH-SY5Y-selle is vir 24 uur met 3 en 5 mM PPA behandel. Proteïenvlakke is gekwantifiseer deur Western blot-analise, en ekspressievlakke is genormaliseer tot totale proteïen. Gemiddelde proteïenekspressie en verteenwoordigende Western blots van teiken- en totale proteïene word getoon. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Stawe verteenwoordig gemiddelde ± SEM, en data wat getoon word, is verteenwoordigend van n = 3 biologiese replikate. Veelvuldige vergelykings (p < 0.05) is uitgevoer met behulp van eenrigting-variansie-analise en Dunnett se toets. Die oorspronklike gel en blot word in Figuur S1 getoon.
Mitochondriale disfunksie word geassosieer met multisisteemsiektes, wat wissel van metaboliese, kardiovaskulêre en spiersiektes tot neurologiese siektes1,10. Baie neurodegeneratiewe en neurodegeneratiewe siektes word geassosieer met mitochondriale disfunksie, wat die belangrikheid van hierdie organelle dwarsdeur die lewensduur van die brein beklemtoon. Hierdie siektes sluit in Parkinson se siekte, Alzheimer se siekte en ASS3,4,18. Toegang tot breinweefsel om hierdie siektes te bestudeer, is egter moeilik, veral op die meganistiese vlak, wat sellulêre modelstelsels 'n noodsaaklike alternatief maak. In hierdie studie gebruik ons ​​'n sellulêre modelstelsel wat PPA-behandelde SH-SY5Y-selle gebruik om die mitochondriale disfunksie wat in neuronale siektes, veral outismespektrumversteurings, waargeneem word, te rekapituleer. Die gebruik van hierdie PPA-model om mitochondriale dinamika in neurone te bestudeer, kan insig gee in die etiologie van ASS.
Ons het die moontlikheid ondersoek om TEM te gebruik om veranderinge in mitochondriale morfologie te bekyk. Dit is belangrik om daarop te let dat TEM korrek gebruik moet word om die doeltreffendheid daarvan te maksimeer. Voorbereiding van krio-monsters maak voorsiening vir beter bewaring van neuronale strukture deur gelyktydig sellulêre komponente te fixeer en die vorming van artefakte te verminder34. In ooreenstemming hiermee het ons waargeneem dat neuronagtige SH-SY5Y-selle intakte subsellulêre organelle en verlengde mitochondria gehad het (Fig. 1a). Dit beklemtoon die nut van kriogeniese voorbereidingstegnieke vir die bestudering van mitochondriale morfologie in neuronale selmodelle. Alhoewel kwantitatiewe metings krities is vir objektiewe analise van TEM-data, is daar steeds geen konsensus oor watter spesifieke parameters gemeet moet word om mitochondriale morfologiese veranderinge te bevestig nie. Gebaseer op 'n groot aantal studies wat mitochondriale morfologie17,31,32 kwantitatief ondersoek het, het ons 'n outomatiese mitochondriale beeldanalisepyplyn ontwikkel wat agt morfologiese parameters meet, naamlik: area, area2, aspekverhouding, omtrek, sirkelvormigheid, graad, Feret-deursnee en rondheid.
Onder hulle het PPA area 2, area, omtrek en Feret-deursnee aansienlik verminder (Fig. 1b-e). Dit het getoon dat mitochondria kleiner en meer afgerond geword het, wat ooreenstem met vorige studies wat 'n afname in mitochondriale area toon na 72 uur van PPA30-geïnduseerde mitochondriale stres. Hierdie morfologiese kenmerke kan dui op mitochondriale splitsing, 'n noodsaaklike proses om beskadigde komponente van die mitochondriale netwerk te sekwestreer om hul afbraak deur mitofagie te bevorder35,36,37. Aan die ander kant kan die afname in gemiddelde mitochondriale grootte geassosieer word met verhoogde biogenese, wat lei tot die vorming van klein ontluikende mitochondria. Verhoogde splitsing of biogenese verteenwoordig 'n kompenserende reaksie om mitose teen mitochondriale stres te handhaaf. Verminderde mitochondriale groei, verswakte fusie of ander toestande kan egter nie uitgesluit word nie.
Alhoewel die hoëresolusiebeelde wat deur TEM geskep word, die bepaling van morfologiese eienskappe op die vlak van individuele mitochondria moontlik maak, produseer hierdie metode tweedimensionele momentopnames op 'n enkele tydstip. Om dinamiese reaksies op metaboliese stres te bestudeer, het ons mitochondria met TMRE gekleur en tydverloopmikroskopie met MEL-analise gebruik, wat hoë-deurset 3D-visualisering van veranderinge in die mitochondriale netwerk oor tyd moontlik maak33,38. Ons het subtiele maar beduidende veranderinge in mitochondriale dinamika onder PPA-stres waargeneem (Fig. 2). By 3 mM het die aantal splitsingsgebeurtenisse aansienlik toegeneem, terwyl fusiegebeurtenisse dieselfde gebly het as in die kontrole. 'n Toename in die aantal beide splitsings- en fusiegebeurtenisse is by 5 mM PPA waargeneem, maar hierdie veranderinge was ongeveer proporsioneel, wat daarop dui dat splitsings- en fusiekinetika ewewig bereik by hoër konsentrasies (Fig. 2b). Die gemiddelde mitochondriale volume het onveranderd gebly by beide 3 en 5 mM PPA, wat aandui dat die integriteit van die mitochondriale netwerk bewaar gebly het (Fig. 2d). Dit weerspieël die vermoë van dinamiese mitochondriale netwerke om op ligte metaboliese stres te reageer om homeostase effektief te handhaaf sonder om netwerkfragmentasie te veroorsaak. Teen 3 mM PPA is die toename in splitsing voldoende om die oorgang na 'n nuwe ewewig te bevorder, maar meer diepgaande kinetiese hermodellering is nodig in reaksie op stres wat deur hoër konsentrasies PPA veroorsaak word.
Die aantal mitochondria het by beide PPA-streskonsentrasies toegeneem, maar die gemiddelde mitochondriale volume het nie beduidend verander nie (Fig. 2c). Dit kan wees as gevolg van verhoogde biogenese of verhoogde deling; in die afwesigheid van 'n beduidende afname in gemiddelde mitochondriale volume, is dit egter meer waarskynlik dat biosintese toeneem. Die data in Figuur 2 ondersteun egter die bestaan ​​van twee kompenserende meganismes: 'n toename in die aantal splitsingsgebeurtenisse, wat ooreenstem met opregulering van mitochondriale splitsing, en 'n toename in die aantal gebeurtenisse, wat ooreenstem met mitochondriale biogenese. Uiteindelik kan dinamiese kompensasie vir ligte stres bestaan ​​uit gelyktydige prosesse wat splitsing, fusie, biogenese en mitofagie behels. Alhoewel vorige outeurs getoon het dat PPA mitose30,39 en mitofagie29 verbeter, verskaf ons bewyse vir die hermodellering van mitochondriale splitsing- en fusiedinamika in reaksie op PPA. Hierdie data bevestig die morfologiese veranderinge wat deur TEM waargeneem word en bied verdere insig in die meganismes wat verband hou met PPA-geïnduseerde mitochondriale disfunksie.
Omdat nóg TEM nóg MEL-analise direkte bewyse gelewer het van die geenregulerende meganismes onderliggend aan die waargenome morfologiese veranderinge, het ons die RNA-uitdrukking van gene wat betrokke is by mitochondriale metabolisme, biogenese en dinamika ondersoek. Die cMYC-proto-onkogeen is 'n transkripsiefaktor wat betrokke is by die regulering van mitochondria, glikolise, aminosuur- en vetsuurmetabolisme40. Daarbenewens is cMYC bekend daarvoor dat dit die uitdrukking van byna 600 mitochondriale gene wat betrokke is by mitochondriale transkripsie, translasie en komplekse samestelling, insluitend NRF1 en TFAM41, reguleer. NRF1 en TFAM is twee sentrale reguleerders van mitose, wat stroomaf van PGC-1α optree om mtDNA-replikasie te aktiveer. Hierdie pad word geaktiveer deur cAMP- en AMPK-seintransduksie en is sensitief vir energieverbruik en metaboliese stres. Ons het ook NFE2L2, 'n redoksreguleerder van mitochondriale biogenese, ondersoek om te bepaal of die effekte van PPA deur oksidatiewe stres bemiddel kan word.
Alhoewel NFE2L2-uitdrukking onveranderd gebly het, het ons 'n konsekwente dosisafhanklike afname in die uitdrukking van cMYC, NRF1 en TFAM gevind na 24 uur se behandeling met 3 mM en 5 mM PPA (Fig. 3a-c). Afregulering van cMYC-uitdrukking is voorheen gerapporteer as 'n reaksie op mitochondriale stres42, en omgekeerd kan afregulering van cMYC-uitdrukking mitochondriale disfunksie veroorsaak deur mitochondriale metabolisme, netwerkkonnektiwiteit en membraanpolarisasie43 te hermodelleer. Interessant genoeg is cMYC ook betrokke by die regulering van mitochondriale splitsing en fusie42,43 en is bekend daarvoor dat dit DRP1-fosforilering en mitochondriale lokalisering tydens seldeling44 verhoog, asook mitochondriale morfologiese hermodellering in neuronale stamselle45 bemiddel. Inderdaad, cMYC-gebrekkige fibroblaste toon verminderde mitochondriale grootte, in ooreenstemming met veranderinge wat deur PPA43-stres veroorsaak word. Hierdie data illustreer 'n interessante, maar nog onduidelike verband tussen cMYC en mitochondriale dinamika, wat 'n interessante teiken bied vir toekomstige studies van PPA-stres-geïnduseerde hermodellering.
Die vermindering van NRF1 en TFAM is in ooreenstemming met die rol van cMYC as 'n belangrike transkripsieaktivator. Hierdie data is ook in ooreenstemming met vorige studies in menslike dikdermkankerselle wat toon dat PPA NRF1 mRNA-uitdrukking na 22 uur verminder het, wat geassosieer is met ATP-uitputting en ROS46 verhoog het. Hierdie outeurs het ook berig dat TFAM-uitdrukking na 8.5 uur toegeneem het, maar na 22 uur na basislynvlakke teruggekeer het. In teenstelling hiermee het Kim et al. (2019) getoon dat TFAM mRNA-uitdrukking beduidend afgeneem het na 4 uur van PPA-stres in SH-SY5Y-selle; na 72 uur was TFAM-proteïenuitdrukking egter beduidend verhoog en die mtDNA-kopienommer beduidend verhoog. Dus sluit die afname in die aantal mitochondriale biogenese-gene wat ons na 24 uur waargeneem het, nie die moontlikheid uit dat die toename in die aantal mitochondria geassosieer word met die aktivering van biogenese op vroeër tydspunte nie. Vorige studies het getoon dat PPA PGC-1α mRNA en proteïen in SH-SY5Y-selle aansienlik opreguleer na 4 uur 30 minute, terwyl propioonsuur mitochondriale biogenese in kalfhepatosiete via PGC-1α na 12 uur 39 minute verbeter. Interessant genoeg is PGC-1α nie net 'n direkte transkripsiereguleerder van NRF1 en TFAM nie, maar is ook getoon dat dit die aktiwiteit van MFN2 en DRP1 reguleer deur fisie en fusie te reguleer47. Saamgevat beklemtoon dit die noue koppeling van meganismes wat mitochondriale kompenserende reaksies reguleer wat deur PPA geïnduseer word. Boonop weerspieël ons data beduidende disregulering van transkripsieregulering van biogenese en metabolisme onder PPA-stres.
Die STOML2-, OPA1-, MFN1-, MFN2- en DRP1-gene is van die sentrale reguleerders van mitochondriale splitsing, fusie en dinamika37,48,49. Daar is baie ander gene betrokke by mitochondriale dinamika, maar STOML2, OPA1 en MFN2 is voorheen gevind om differensieel gemetileer te wees in ASD-kohorte,16 en verskeie onafhanklike studies het veranderinge in hierdie transkripsiefaktore in reaksie op mitochondriale stres gerapporteer50,51.52. Die uitdrukking van beide OPA1 en STOML2 is aansienlik verminder deur 3 mM en 5 mM PPA-behandeling (Fig. 3e, f). OPA1 is een van die klassieke reguleerders van mitochondriale fusie deur direkte interaksie met MFN1 en 2 en speel 'n rol in cristae-hermodellering en mitochondriale morfologie53. Die presiese rol van STOML2 in mitochondriale dinamika bly onduidelik, maar bewyse dui daarop dat dit 'n rol speel in mitochondriale fusie, biogenese en mitofagie.
STOML2 is betrokke by die handhawing van mitochondriale respiratoriese koppeling en die vorming van respiratoriese kettingkomplekse54,55 en daar is getoon dat dit die metaboliese eienskappe van kankerselle diepgaande verander56. Studies het getoon dat STOML2 mitochondriale membraanpotensiaal en biogenese bevorder deur interaksie met BAN en kardiolipien 55, 57, 58. Daarbenewens het onafhanklike studies getoon dat die interaksie tussen STOML2 en PINK1 mitofagie reguleer59,60. Dit is opmerklik dat STOML2 direk interaksie het met en MFN2 stabiliseer en ook 'n belangrike rol speel in die stabilisering van lang OPA1-isovorme deur die protease wat verantwoordelik is vir OPA1-afbraak53,61,62 te inhibeer. Die vermindering in STOML2-uitdrukking wat in PPA-reaksies waargeneem word, kan hierdie fusieproteïene meer vatbaar maak vir afbraak deur ubikwitien- en proteasoom-afhanklike weë48. Alhoewel die presiese rol van STOML2 en OPA1 in die dinamiese reaksie op PPA onduidelik is, kan verminderde uitdrukking van hierdie fusiegene (Figuur 3) die balans tussen splitsing en fusie ontwrig en lei tot verminderde mitochondriale grootte (Figuur 3).
Aan die ander kant het OPA1-proteïenuitdrukking onveranderd gebly na 24 uur, terwyl die mRNA- en proteïenvlakke van MFN1, MFN2 of DRP1 nie beduidend verander het na PPA-behandeling nie (Fig. 3g-i, Fig. 4). Dit kan aandui dat daar geen veranderinge in die regulering van hierdie faktore betrokke by mitochondriale fusie en fisie is nie. Dit is egter die moeite werd om daarop te let dat elk van hierdie vier gene ook gereguleer word deur posttranskripsionele modifikasies (PTM's) wat proteïenaktiwiteit beheer. OPA1 het agt alternatiewe splitsingsvariante wat proteolities in mitochondria gesplyt word om twee afsonderlike isovorme te produseer 63. Die balans tussen lang en kort isovorme bepaal uiteindelik die rol van OPA1 in mitochondriale fusie en instandhouding van die mitochondriale netwerk 64. DRP1-aktiwiteit word gereguleer deur kalsium/kalmodulien-afhanklike proteïenkinase II (CaMKII) fosforilering, terwyl DRP1-afbraak gereguleer word deur ubikwitinering en SUMOilering 65. Laastens, beide DRP1 en MFN1/2 is GTPases, dus aktiwiteit kan beïnvloed word deur die tempo van GTP-produksie in mitochondria 66. Daarom, hoewel die uitdrukking van hierdie proteïene konstant bly, weerspieël dit moontlik nie onveranderde proteïenaktiwiteit of lokalisering nie 67,68. Inderdaad, bestaande PTM-proteïenrepertoires dien dikwels as die eerste verdedigingslinie wat verantwoordelik is vir die bemiddeling van akute stresresponse. In die teenwoordigheid van matige metaboliese stres in ons model, is dit waarskynlik dat PTM verhoogde aktiwiteit van fusie- en splitsingsproteïene bevorder om mitochondriale integriteit voldoende te herstel sonder om addisionele aktivering van hierdie gene op die mRNA- of proteïenvlak te vereis.
Saamgevat beklemtoon die bogenoemde data die komplekse en tydafhanklike regulering van mitochondriale morfologie en die uitdagings om hierdie meganismes te verduidelik. Om geenekspressie te bestudeer, is dit eers nodig om spesifieke teikengene in die roete te identifiseer. Ons data toon egter dat gene in dieselfde roete nie op dieselfde manier op dieselfde stres reageer nie. Trouens, vorige studies het getoon dat verskillende gene in dieselfde roete verskillende temporale reaksieprofiele kan vertoon30,46. Daarbenewens is daar komplekse post-transkripsiemeganismes wat die verhouding tussen transkripsie en geenfunksie ontwrig. Proteomiese studies kan insig gee in die impak van PTM's en proteïenfunksie, maar dit bied ook uitdagings, insluitend lae-deursetmetodes, hoë sein-tot-ruisverhoudings en swak resolusie.
In hierdie konteks het die bestudering van mitochondriale morfologie met behulp van TEM en MEL groot potensiaal om fundamentele vrae oor die verband tussen mitochondriale dinamika en funksie en hoe dit siektes beïnvloed, aan te spreek. Die belangrikste is dat TEM 'n direkte metode bied vir die meting van mitochondriale morfologie as 'n konvergente eindpunt van mitochondriale disfunksie en dinamika51. MEL bied ook 'n direkte metode vir die visualisering van fisie- en fusiegebeure in 'n driedimensionele sellulêre omgewing, wat kwantifisering van dinamiese mitochondriale hermodellering moontlik maak, selfs in die afwesigheid van veranderinge in geenekspressie33. Hier beklemtoon ons die nut van mitochondriale beeldtegnieke in sekondêre mitochondriale siektes. Hierdie siektes word tipies gekenmerk deur chroniese ligte metaboliese stres wat gekenmerk word deur subtiele hermodellering van mitochondriale netwerke eerder as akute mitochondriale skade. Die mitochondriale kompensasie wat nodig is om mitose onder chroniese stres te handhaaf, het egter diepgaande funksionele gevolge. In die konteks van neurowetenskap kan 'n beter begrip van hierdie kompenserende meganismes belangrike inligting verskaf oor die pleiotropiese neuropatologie wat verband hou met mitochondriale disfunksie.
Uiteindelik beklemtoon ons data die nut van beeldtegnieke om die funksionele gevolge van die komplekse interaksies tussen geen-ekspressie, proteïenmodifikasies en proteïenaktiwiteit wat neuronale mitochondriale dinamika beheer, te verstaan. Ons het PPA gebruik om mitochondriale disfunksie in 'n neuronale selmodel te modelleer om insig te verkry in die mitochondriale komponent van ASD. SH-SY5Y-selle wat met PPA behandel is, het veranderinge in mitochondriale morfologie getoon: mitochondria het klein en rond geword, en cristae was swak gedefinieer toe dit deur TEM waargeneem is. MEL-analise toon dat hierdie veranderinge gelyktydig plaasvind met 'n toename in fisie- en fusiegebeurtenisse om die mitochondriale netwerk te handhaaf in reaksie op ligte metaboliese stres. Boonop ontwrig PPA die transkripsieregulering van mitochondriale metabolisme en homeostase aansienlik. Ons het cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 en OPA1 geïdentifiseer as sleutel mitochondriale reguleerders wat deur PPA-stres ontwrig word en kan 'n rol speel in die bemiddeling van PPA-geïnduseerde veranderinge in mitochondriale morfologie en funksie. Toekomstige studies is nodig om PPA-geïnduseerde temporale veranderinge in geen-ekspressie en proteïenaktiwiteit, lokalisering en post-translasionele modifikasies beter te karakteriseer. Ons data beklemtoon die kompleksiteit en interafhanklikheid van die regulatoriese meganismes wat die mitochondriale stresrespons bemiddel en demonstreer die nut van TEM en ander beeldtegnieke vir meer geteikende meganistiese studies.
Die SH-SY5Y-sellyn (ECACC, 94030304-1VL) is van Sigma-Aldrich aangekoop. SH-SY5Y-selle is gekweek in Dulbecco se gemodifiseerde Eagle-medium/F-12-voedingstofmengsel (DMEM/F-12) en L-glutamien (SC09411, ScienCell) in 25 cm2-flesse aangevul met 20% fetale beeserum (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) en 1% penisillien-streptomisien (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) teen 37 °C, 5% CO2. Selle is tot 80% konfluensie gesubkweek met behulp van 0.05% tripsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), gesentrifugeer teen 300 g en uitgeplaat teen 'n digtheid van ongeveer 7 × 105 selle/ml. Alle eksperimente is uitgevoer op ongedifferensieerde SH-SY5Y-selle tussen gedeeltes 19–22. PPA word as NaP toegedien. Los NaP-poeier (CAS-nr. 137-40-6, chemiese formule C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) op in warm MilliQ-water tot 'n konsentrasie van 1 M en bêre by 4 °C. Verdun hierdie oplossing op die dag van behandeling met 1 M PPA tot 3 mM en 5 mM PPA in serumvrye medium (DMEM/F-12 met L-glutamien). Behandelingskonsentrasies vir alle eksperimente was geen PPA (0 mM, kontrole), 3 mM en 5 mM PPA. Eksperimente is in ten minste drie biologiese replikate uitgevoer.
SH-SY5Y-selle is in 25 cm³-flesse gesaai teen 'n tempo van 5.5 × 10³ selle/ml en vir 24 uur gekweek. Die PPA-behandeling is voor 24 uur van inkubasie by die fles gevoeg. Versamel selpellets volgens normale soogdierweefsel-subkultuurprotokolle (hierbo beskryf). Hersuspendeer die selpellet in 100 µl 2.5% glutaraldehied, 1× PBS en bêre by 4 °C tot verwerking. SH-SY5Y-selle is kortliks gesentrifugeer om die selle te pelleteer en 2.5% glutaraldehied, 1× PBS-oplossing, te verwyder. Hersuspendeer die sediment in 'n 4% agarosegel wat in gedistilleerde water voorberei is (die verhouding van agarose tot sedimentvolume is 1:1). Agarose-stukke is op roosters op plat plate geplaas en met 1-heksadeceen bedek voor hoëdrukvries. Monsters is vir 24 uur in 100% droë asetoon by -90°C gevries. Die temperatuur is toe verhoog tot -80°C en 'n oplossing van 1% osmiumtetroksied en 0.1% glutaraldehied is bygevoeg. Monsters is vir 24 uur by -80°C gestoor. Daarna is die temperatuur geleidelik oor 'n paar dae tot kamertemperatuur verhoog: van –80 °C tot –50 °C vir 24 uur, tot –30 °C vir 24 uur, tot –10 °C vir 24 uur en uiteindelik tot kamertemperatuur.
Na kriogeniese voorbereiding is die monsters met hars geïmpregneer en ultradun snitte (∼100 nm) is gemaak met behulp van 'n Leica Reichert UltracutS ultramikrotoom (Leica Microsystems). Snitte is gekleur met 2% uranielasetaat en loodsitraat. Monsters is waargeneem met behulp van 'n FEI Tecnai 20 transmissie-elektronmikroskoop (ThermoFisher (voorheen FEI), Eindhoven, Nederland) wat teen 200 kV (Lab6-sender) werk en 'n Gatan CCD-kamera (Gatan, VK) toegerus met 'n Tridiem-energiefilter.
In elke tegniese replikaat is ten minste 24 enkelselbeelde verkry, vir 'n totaal van 266 beelde. Alle beelde is geanaliseer met behulp van die Region of Interest (ROI) makro en die Mitochondria makro. Die mitochondriale makro is gebaseer op gepubliseerde metodes17,31,32 en laat semi-outomatiese bondelverwerking van TEM-beelde in Fiji/ImageJ69 toe. In 'n neutedop: die beeld word omgekeerd en omgekeerd met behulp van rollende bal agtergrond aftrekking (60 pixel radius) en 'n FFT banddeurlaatfilter (met behulp van onderskeidelik 60 en 8 pixel boonste en onderste grense) en vertikale lynonderdrukking met 'n oriëntasietoleransie van 5%. Die verwerkte beeld word outomaties gedrempel met behulp van 'n maksimum entropie-algoritme en 'n binêre masker word gegenereer. Beeldstreke wat geassosieer word met handmatig geselekteerde ROI's in rou TEM-beelde is onttrek, wat mitochondria karakteriseer en die plasmamembraan en ander hoëkontrasstreke uitsluit. Vir elke geëkstraheerde ROI is binêre deeltjies groter as 600 pixels geanaliseer, en deeltjieoppervlakte, omtrek, hoof- en byasse, Feret-deursnee, rondheid en sirkelvormigheid is gemeet met behulp van die ingeboude meetfunksies van Fiji/ImageJ. Volgens Merrill, Flippo en Strack (2017) is oppervlakte 2, deeltjie-aspekverhouding (hoof- tot byasverhouding) en vormfaktor (FF) uit hierdie data bereken, waar FF = omtrek 2/4pi x oppervlakte. Die definisie van die parametriese formule kan gevind word in Merrill, Flippo en Strack (2017). Die genoemde makro's is beskikbaar op GitHub (sien Data Beskikbaarheidsverklaring). Gemiddeld is ongeveer 5 600 deeltjies per PPA-behandeling geanaliseer, vir 'n totaal van ongeveer 17 000 deeltjies (data nie getoon nie).
SH-SH5Y-selle is in 8-kamer-kweekskottels (ThermoFisher, #155411) geplaas om oornag adhesie toe te laat en toe geïnkubeer met TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) en Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). kleuring. Beelde is verkry met behulp van 405 nm en 561 nm lasers oor 'n 10 min omgewing, en rou beelde is verkry as z-stapels wat 10 beeldmikrograwe bevat met 'n az-stap van 0.2 μm tussen beeldrame op 12 opeenvolgende tydpunte. Beelde is versamel met behulp van 'n Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 superresolusieplatform (Carl Zeiss, Oberkochen, Duitsland) met behulp van 'n LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27-lens. Beelde is in ImageJ geanaliseer met behulp van 'n voorheen beskryfde pyplyn en die ImageJ-inprop om fusie- en splitsingsgebeurtenisse, gemiddelde aantal mitochondriale strukture en gemiddelde mitochondriale volume per sel te meet. MEL-makro's is beskikbaar op GitHub (sien Data Beskikbaarheidsverklaring).
SH-SY5Y-selle is vir 24 uur voor behandeling in ses-putplate gekweek teen 'n digtheid van 0.3 × 106 selle/ml. RNA is geëkstraheer met behulp van die Quick-RNA™ Miniprep-protokol (ZR R1055, Zymo Research) met geringe wysigings: voeg 300 μl RNA-lisebuffer by elke putjie voor verwydering en liseer elke monster as 'n laaste stap met 30 μl DNase/RNase-eluering. -vrye water. Alle monsters is vir kwantiteit en kwaliteit nagegaan met behulp van 'n NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spektrofotometer. Totale proteïen van sellisate is verkry met behulp van 200 μl RIPA-lisebuffer, en proteïenkonsentrasie is gekwantifiseer met behulp van die Bradford-proteïentoets70.
cDNA-sintese is uitgevoer met behulp van die Tetro™ cDNA-sintesekit (BIO-65043, Meridian Bioscience) volgens die vervaardiger se instruksies met 'n paar wysigings. cDNA is gesintetiseer in 20-μl-reaksies met behulp van 0.7 tot 1 μg totale RNS. Primers is gekies uit voorheen gepubliseerde artikels 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabel S1) en gepaardgaande probes is ontwerp met behulp van die PrimerQuest-instrument van Integrated DNA Technologies. Alle gene van belang is genormaliseer na die kern B2M-geen. Die geen-ekspressie van STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC en OPA1 is gemeet deur RT-qPCR. Die meestermengsel het LUNA Taq-polimerase (M3003L, New England Biolabs), 10 μM voorwaartse en terugwaartse primers, cDNA en PCR-graad water ingesluit om 'n finale volume van 10 μL vir elke reaksie te lewer. Ekspressie van delings- en splitsingsgene (DRP1, MFN1/2) is gemeet met behulp van TaqMan-multipleks-assays. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) is volgens die vervaardiger se instruksies met geringe wysigings gebruik. Die multipleks RT-qPCR-meestermengsel sluit 1X LUNA Taq-polimerase, 10 μM voorwaartse en terugwaartse primers, 10 μM probe, cDNA en PCR-graad water in, wat 'n finale volume van 20 μL vir elke reaksie tot gevolg het. RT-qPCR is uitgevoer met behulp van Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—serienommer: R0618110). Siklustoestande word in Tabel S1 getoon. Alle cDNA-monsters is in drievoud geamplifiseer en 'n standaardkurwe is gegenereer met behulp van 'n reeks tienvoudige verdunnings. Uitskieters in drievoudige monsters met 'n siklusdrempelstandaardafwyking (Ct) > 0.5 is uit die analise verwyder om data-reproduceerbaarheid te verseker30,72. Relatiewe geenekspressie is bereken met behulp van die 2-ΔΔCt79-metode.
Proteïenmonsters (60 μg) is gemeng met Laemmli-laaibuffer teen 'n 2:1-verhouding en op 'n 12% kleurlose proteïengel (Bio-Rad #1610184) uitgevoer. Proteïene is oorgedra na 'n PVDF (polivinilideenfluoried) membraan (#170-84156, Bio-Rad) met behulp van die Trans-Blot Turbo-stelsel (#170-4155, Bio-Rad). Die membraan is geblokkeer en geïnkubeer met die toepaslike primêre teenliggaampies (OPA1, MFN1, MFN2, en DRP1) (verdun 1:1000) vir 48 uur, gevolg deur inkubasie met sekondêre teenliggaampies (1:10 000) vir 1 uur. Membrane is toe afgebeeld met behulp van Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) en opgeneem met behulp van 'n Bio-Rad ChemiDoc MP-stelsel. ImageLab weergawe 6.1 is gebruik vir Western blot-analise. Die oorspronklike gel en klep word in Figuur S1 getoon. Teenliggaaminligting word in Tabel S2 verskaf.
Datastelle word aangebied as die gemiddelde en standaardfout van die gemiddelde (SEM) van ten minste drie onafhanklike steekproewe. Datastelle is getoets vir normaliteit met behulp van die Shapiro-Wilks-toets (tensy anders vermeld) voordat 'n Gauss-verspreiding en gelyke standaardafwykings aangeneem is en met die ontledings voortgegaan is. Benewens die ontleding van die datastel met behulp van Fisher se MEL LSD (p < 0.05), eenrigting-ANOVA (behandeling teenoor kontrole-gemiddelde) en Dunnett se meervoudige vergelykingstoets om betekenisvolheid te bepaal (p < 0.05). Beduidende p-waardes word in die grafiek getoon as *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Alle statistiese ontledings en grafieke is uitgevoer en gegenereer met behulp van GraphPad Prism 9.4.0.
Fiji/ImageJ-makro's vir TEM-beeldanalise is publiek beskikbaar op GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Die Mitochondrial Event Locator (MEL)-makro is publiek beskikbaar op GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM en Vijaya A. Mitochondria: meesterreguleerders van metabolisme, homeostase, stres, veroudering en epigenetika. Indonesies. Biomediese Wetenskap. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Veelvlakkige mitochondriale disfunksie in skisofrenie, kompleks I as 'n moontlike patologiese teiken. Skisofrenie. hulpbron. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. en Beal, MF Mitochondriale disfunksie in Parkinson se siekte. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG en Mehta V. Beklemtoonde mitochondria: teikens van inval in Alzheimer se siekte. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF en Ferreira GK Mitochondria en die brein: bio-energetika en meer. Neurotoksiene. hulpbron. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Pleiotropiese mitochondria: die impak van mitochondria op neuronale ontwikkeling en siekte. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. en Morais, VA Mitochondriale biogenese in neurone: hoe en waar. internasionaliteit. J. Mohr. die wetenskap. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. en Zhao, J. Regulering van mitochondriale dinamika by soogdiere: geleenthede en uitdagings. front. endokrien. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. en Slack, RS Mitochondriale dinamika in die regulering van neurogenese: van die ontwikkelende tot volwasse brein. ontwikkeling. dinamika. 247, 47–53 (2018).