Dankie dat u Nature.com besoek het. Die blaaierweergawe wat u gebruik, het beperkte ondersteuning vir CSS. Vir die beste ervaring beveel ons aan dat u 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer afskakel). Intussen, om voortgesette ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript vertoon.
Insulien-nanopartikels (NP's) met 'n hoë ladingsinhoud het verskillende toepassings in verskillende dosisvorme gevind. Hierdie werk het ten doel om die effek van vriesdroging- en spuitdrogingsprosesse op die struktuur van insulien-gelaaide chitosan-nanopartikels te evalueer, met of sonder mannitol as 'n krioprotekteermiddel. Ons het ook die kwaliteit van hierdie nanopartikels beoordeel deur hulle weer op te los. Voor dehidrasie is die deeltjiegrootte van die chitosan/natriumtripolifosfaat/insulien-kruisgekoppelde nanopartikels geoptimaliseer tot 318 nm, die PDI was 0.18, die inkapselingsdoeltreffendheid was 99.4% en die lading was 25.01%. Na herkonstitusie het alle nanopartikels, behalwe dié wat deur 'n vriesdrogingsmetode sonder die gebruik van mannitol geproduseer is, hul sferiese deeltjiestruktuur behou. In vergelyking met mannitolbevattende nanopartikels wat deur spuit gedehidreer is, het mannitolvrye spuitgedroogde nanopartikels ook die kleinste gemiddelde deeltjiegrootte (376 nm) en die hoogste ladingsinhoud getoon. (25.02%) met soortgelyke inkapselingstempo (98.7%) en PDI (0.20) deur droog- of vriesdroogtegnieke. Die gedroogde nanopartikels deur sproeidroging sonder mannitol het ook gelei tot die vinnigste vrystelling van insulien en die hoogste doeltreffendheid van sellulêre opname. Hierdie werk toon dat sproeidroging insulien-nanopartikels kan dehidreer sonder die behoefte aan krioprotekteermiddels in vergelyking met konvensionele vriesdroogmetodes, wat groter laaikapasiteit, laer bymiddelvereistes en bedryfskoste 'n beduidende voordeel skep.
Sedert die ontdekking daarvan in 19221,2,3 het insulien en die farmaseutiese preparate daarvan die lewens van pasiënte met tipe 1-diabetes (T1DM) en tipe 2-diabetes (T1DM) gered. As gevolg van die eienskappe daarvan as 'n hoë molekulêre gewig proteïen, word insulien egter maklik geaggregeer, deur proteolitiese ensieme afgebreek en deur die eerste-deurgangseffek uitgeskakel. Mense wat met tipe 1-diabetes gediagnoseer is, benodig insulieninspuitings vir die res van hul lewens. Baie pasiënte wat aanvanklik met tipe 2-diabetes gediagnoseer is, benodig ook langtermyn insulieninspuitings. Daaglikse insulieninspuitings is 'n ernstige bron van daaglikse pyn en ongemak vir hierdie individue, met negatiewe gevolge vir geestesgesondheid. Gevolglik word ander vorme van insulientoediening wat minder ongemak veroorsaak, soos orale insulientoediening, breedvoerig bestudeer5, aangesien dit die potensiaal het om die lewensgehalte van ongeveer 5 miljard mense met diabetes wêreldwyd te herstel.
Nanopartikeltegnologie het 'n beduidende vooruitgang gebring in pogings om orale insulien in te neem4,6,7. Een wat insulien effektief inkapsel en beskerm teen afbraak vir geteikende aflewering na spesifieke liggaamsdele. Die gebruik van nanopartikelformulerings het egter verskeie beperkings, hoofsaaklik as gevolg van stabiliteitsprobleme van partikelsuspensies. 'n Sekere aggregasie kan tydens berging voorkom, wat die biobeskikbaarheid van insulien-gelaaide nanopartikels8 verminder. Daarbenewens moet die chemiese stabiliteit van die polimeermatriks van nanopartikels en insulien ook in ag geneem word om die stabiliteit van insulien-nanopartikels (NP's) te verseker. Tans is vriesdroogtegnologie die goue standaard vir die skep van stabiele NP's terwyl ongewenste veranderinge tydens berging9 voorkom word.
Vriesdroging vereis egter die byvoeging van krioprotekteermiddels om te verhoed dat die sferiese struktuur van NP's deur die meganiese spanning van yskristalle beïnvloed word. Dit verminder die lading van insulien-nanopartikels na liofilisering aansienlik, aangesien die krioprotekteermiddel die meeste van die gewigsverhouding beslaan. Daarom word die geproduseerde insulien-NP's dikwels ongeskik gevind vir die vervaardiging van droëpoeierformulerings, soos orale tablette en orale films, as gevolg van die behoefte aan groot hoeveelhede droë nanopartikels om die terapeutiese venster van insulien te bereik.
Spuitdroging is 'n bekende en goedkoop industriële proses vir die vervaardiging van droë poeiers uit vloeibare fases in die farmaseutiese industrie10,11. Beheer oor die deeltjievormingsproses maak voorsiening vir behoorlike inkapseling van verskeie bioaktiewe verbindings12, 13. Verder het dit 'n effektiewe tegniek geword vir die voorbereiding van ingekapselde proteïene vir orale toediening. Tydens spuitdroging verdamp water baie vinnig, wat help om die temperatuur van die deeltjiekern laag te hou11,14, wat die toepassing daarvan om hitte-sensitiewe komponente in te kapsel moontlik maak. Voor spuitdroging moet die bedekkingsmateriaal deeglik gehomogeniseer word met die oplossing wat die ingekapselde bestanddele bevat11,14. Anders as vriesdroging, verbeter homogenisering voor inkapseling in spuitdroging die inkapselingsdoeltreffendheid tydens dehidrasie. Aangesien die spuitdrogings-inkapselingsproses nie kriobeskermers benodig nie, kan spuitdroging gebruik word om gedroogde NP's met 'n hoë ladingsinhoud te produseer.
Hierdie studie rapporteer die produksie van insulien-gelaaide NP's deur kruisbinding van chitosan en natriumtripolifosfaat met behulp van 'n ioongelmetode. Ioongelering is 'n voorbereidingsmetode wat die produksie van nanopartikels deur elektrostatiese interaksies tussen twee of meer ioniese spesies onder sekere toestande moontlik maak. Beide vriesdroging- en sproeidrogingstegnieke is gebruik om die geoptimaliseerde chitosan/natriumtripolifosfaat/insulien-kruisgekoppelde nanopartikels te dehidreer. Na dehidrasie is hul morfologie deur SEM geanaliseer. Hul rekombinasievermoë is geëvalueer deur hul grootteverspreiding, oppervlaklading, PDI, inkapselingsdoeltreffendheid en laai-inhoud te meet. Die kwaliteit van heroplosbare nanopartikels wat deur verskillende dehidrasiemetodes geproduseer is, is ook geëvalueer deur hul insulienbeskerming, vrystellingsgedrag en sellulêre opname-doeltreffendheid te vergelyk.
Die pH van die gemengde oplossing en die verhouding van chitosan en insulien is twee sleutelfaktore wat die deeltjiegrootte en inkapselingsdoeltreffendheid (EE) van die finale NP's beïnvloed, aangesien dit die ionotropiese geleringsproses direk beïnvloed. Daar is getoon dat die pH van die gemengde oplossing hoogs gekorreleer is met deeltjiegrootte en inkapselingsdoeltreffendheid (Fig. 1a). Soos getoon in Fig. 1a, het die gemiddelde deeltjiegrootte (nm) afgeneem en die EE aansienlik toegeneem toe die pH van 4.0 tot 6.0 toegeneem het, terwyl die gemiddelde deeltjiegrootte begin toeneem het toe die pH tot 6.5 gestyg het en die EE onveranderd gebly het. Namate die verhouding van chitosan tot insulien toeneem, neem die gemiddelde deeltjiegrootte ook toe. Verder is geen verandering in EE waargeneem toe nanopartikels voorberei is teen 'n massaverhouding van chitosan/insulien hoër as 2.5:1 (g/g) nie (Fig. 1b). Daarom is die optimale voorbereidingsomstandighede in hierdie studie (pH 6.0, chitosan/insulien massaverhouding van 2.5:1) gebruik. om insulien-gelaaide nanopartikels voor te berei vir verdere studie. Onder hierdie voorbereidingsomstandighede is die gemiddelde partikelgrootte van insulien-nanopartikels geoptimaliseer tot 318 nm (Fig. 1c), die PDI was 0.18, die inbeddingsdoeltreffendheid was 99.4%, die zeta-potensiaal was 9.8 mv, en die insulienlading was 25.01% (m/m). Gebaseer op transmissie-elektronmikroskopie (TEM) resultate, was die geoptimaliseerde nanopartikels rofweg sferies en diskreet met relatief eenvormige grootte (Fig. 1d).
Parameteroptimalisering van insulien-nanopartikels: (a) die effek van pH op die gemiddelde deursnee en inkapselingsdoeltreffendheid (EE) van insulien-nanopartikels (voorberei teen 'n 5:1 massaverhouding van chitosan en insulien); (b) chitosan en die invloed van die massaverhouding van insulien op die gemiddelde deursnee en inkapselingsdoeltreffendheid (EE) van insulien-nanopartikels (voorberei teen pH 6); (c) deeltjiegrootteverspreiding van geoptimaliseerde insulien-nanopartikels; (d) TEM-mikrograaf van geoptimaliseerde insulien-nanopartikels.
Dit is welbekend dat chitosan 'n swak poliëlektroliet met 'n pKa van 6.5 is. Dit is positief gelaai in suur media omdat die hoofaminogroep deur waterstofione geprotoneer word15. Daarom word dit dikwels as 'n draer gebruik om negatief gelaaide makromolekules in te kapsel. In hierdie studie is chitosan gebruik om insulien met 'n isoëlektriese punt van 5.3 in te kapsel. Aangesien chitosan as 'n bedekkingsmateriaal gebruik word, neem die dikte van die buitenste laag van die nanopartikels ooreenstemmend toe met die toename van die verhouding daarvan, wat lei tot 'n groter gemiddelde deeltjiegrootte. Boonop kan hoër vlakke van chitosan meer insulien inkapsel. In ons geval was EE die hoogste toe die verhouding van chitosan en insulien 2.5:1 bereik het, en daar was geen beduidende verandering in EE toe die verhouding aanhou toeneem het nie.
Behalwe vir die verhouding van chitosan en insulien, het pH ook 'n belangrike rol gespeel in die voorbereiding van NP's. Gan et al. 17 het die effek van pH op die deeltjiegrootte van chitosan-nanopartikels bestudeer. Hulle het 'n voortdurende afname in deeltjiegrootte gevind totdat die pH 6.0 bereik het, en 'n beduidende toename in deeltjiegrootte is waargeneem by pH > 6.0, wat ooreenstem met ons waarnemings. Hierdie verskynsel is te wyte aan die feit dat met toenemende pH, die insulienmolekule 'n negatiewe oppervlaklading verkry, wat elektrostatiese interaksies met die chitosan/natriumtripolifosfaat (TPP)-kompleks bevoordeel, wat lei tot klein deeltjiegrootte en hoë EE. Toe die pH egter tot 6.5 aangepas is, is die aminogroepe op chitosan gedeprotoneer, wat chitosanvouing tot gevolg gehad het. Dus lei hoë pH tot minder blootstelling van aminoione aan TPP en insulien, wat lei tot laer kruisbinding, groter finale gemiddelde deeltjiegrootte en laer EE.
Analise van die morfologiese eienskappe van gevriesdroogde en spuitgedroogde NP's kan die keuse van beter dehidrasie- en poeiervormingstegnieke lei. Die voorkeurmetode moet geneesmiddelstabiliteit, eenvormige deeltjievorm, hoë geneesmiddellading en goeie oplosbaarheid in die oorspronklike oplossing bied. In hierdie studie, om die twee tegnieke beter te vergelyk, is insulien-NP's met of sonder 1% mannitol tydens dehidrasie gebruik. Mannitol word as 'n vulmiddel of kriobeskermingsmiddel in verskeie droëpoeierformulerings vir vriesdroging en spuitdroging gebruik. Vir die gevriesdroogde insulien-nanopartikels sonder mannitol, soos getoon in Figuur 2a, is 'n hoogs poreuse poeierstruktuur met groot, onreëlmatige en growwe oppervlaktes waargeneem onder skandeerelektronmikroskopie (SEM). Min afsonderlike deeltjies is in die poeier na dehidrasie opgespoor (Fig. 2e). Hierdie resultate het aangedui dat die meeste NP's tydens vriesdroging ontbind is sonder enige kriobeskermingsmiddel. Vir gevriesdroogde en spuitgedroogde insulien-nanopartikels wat 1% mannitol bevat, is sferiese nanopartikels met gladde oppervlaktes waargeneem (Fig. 2b, d, f, h). Insulien Nanopartikels wat sonder mannitol gesproeidroog is, het sferies gebly, maar gekreukel op die oppervlak (Fig. 2c). Sferiese en gekreukelde oppervlaktes word verder bespreek in die vrystellingsgedrag- en sellulêre opnametoetse hieronder. Gebaseer op die sigbare voorkoms van die gedroogde NP's, het beide gesproeidroogde NP's sonder mannitol en NP's wat met mannitol gevriesdroog en gesproeidroog is, fyn NP-poeiers opgelewer (Fig. 2f, g, h). Hoe groter die oppervlakarea tussen die deeltjie-oppervlaktes, hoe hoër die oplosbaarheid en dus hoe hoër die vrystellingstempo.
Morfologie van verskillende gedehidreerde insulien-NP's: (a) SEM-beeld van gevriesdroogde insulien-NP's sonder mannitol; (b) SEM-beeld van gevriesdroogde insulien-NP's met mannitol; (c) sproeigedroogde insulien-NP's sonder mannitol SEM-beeld van ; (d) SEM-beeld van insulien-NP's gevriesdroog met mannitol; (e) beeld van gevriesdroogde insulien-NP's poeier sonder mannitol; (f) beeld van gevriesdroogde insulien-NP's met mannitol; (g) Beeld van spuitgedroogde insulien-NP's poeier sonder mannitol; (h) beeld van spuitgedroogde insulien-NP's poeier met mannitol.
Tydens vriesdroging tree mannitol op as 'n krioprotekteermiddel, wat NP's in 'n amorfe vorm hou en skade deur yskristalle voorkom19. In teenstelling hiermee is daar geen vriesstap tydens spuitdroging nie. Daarom is mannitol nie in hierdie metode nodig nie. Trouens, spuitgedroogde NP's sonder mannitol het fyner NP's opgelewer soos voorheen beskryf. Mannitol kan egter steeds as 'n vulstof in die spuitdroogproses optree om NP's 'n meer sferiese struktuur20 te gee (Fig. 2d), wat help om 'n eenvormige vrystellingsgedrag van sulke ingekapselde NP's te verkry. Daarbenewens is dit duidelik dat sommige groot deeltjies in beide vriesgedroogde en spuitgedroogde insulien-NP's wat mannitol bevat, opgespoor kan word (Fig. 2b,d), wat moontlik te wyte is aan die ophoping van mannitol in die deeltjiekern saam met die ingekapselde insulien. Aan.Chitosanlaag.Dit is opmerklik dat in hierdie studie, om te verseker dat die sferiese struktuur na dehidrasie ongeskonde bly, die verhouding van mannitol en chitosan op 5:1 gehou word, sodat 'n groot hoeveelheid vulstof ook die deeltjiegrootte van die gedroogde NP's kan vergroot.
Fourier-transform infrarooi verswakte totale refleksie (FTIR-ATR) spektroskopie het die fisiese mengsel van vrye insulien, chitosan, chitosan, TPP en insulien gekarakteriseer. Alle gedehidreerde NP's is gekarakteriseer deur FTIR-ATR spektroskopie te gebruik. Dit is opmerklik dat bandintensiteite van 1641, 1543 en 1412 cm-1 waargeneem is in ingekapselde NP's wat met mannitol gevriesdroog is en in NP's wat met en sonder mannitol gesproeidroog is (Fig. 3). Soos voorheen gerapporteer, was hierdie toenames in sterkte geassosieer met kruisbinding tussen chitosan, TPP en insulien. Ondersoek na die interaksie tussen chitosan en insulien het getoon dat in die FTIR-spektra van insulien-gelaaide chitosan-nanopartikels die chitosanband oorvleuel het met dié van insulien, wat die karbonielintensiteits- (1641 cm-1) en amien- (1543 cm-1) band verhoog het. Die tripolifosfaatgroepe van TPP is gekoppel aan ammoniumgroepe in chitosan, wat 'n band vorm by 1412 cm-1.
FTIR-ATR-spektra van vrye insulien, chitosan, fisiese mengsels van chitosan/TPP/insulien en NP's wat deur verskillende metodes gedehidreer is.
Verder stem hierdie resultate ooreen met dié wat in SEM getoon is, wat getoon het dat die ingekapselde NP's ongeskonde gebly het beide wanneer dit met mannitol gespuit en gevriesdroog is, maar in die afwesigheid van mannitol het slegs sproeidroging ingekapselde deeltjies geproduseer. In teenstelling hiermee was die FTIR-ATR spektrale resultate van NP's wat sonder mannitol gevriesdroog is, baie soortgelyk aan die fisiese mengsel van chitosan, TPP en insulien. Hierdie resultaat dui daarop dat die kruisbindings tussen chitosan, TPP en insulien nie meer teenwoordig is in NP's wat sonder mannitol gevriesdroog is nie. Die NP-struktuur is vernietig tydens vriesdroging sonder kriobeskermingsmiddel, wat in die SEM-resultate gesien kan word (Fig. 2a). Gebaseer op die morfologie en FTIR-resultate van gedehidreerde insulien-NP's, is slegs gevriesdroogde, sproeidroogde en mannitolvrye NP's gebruik vir rekonstitutie-eksperimente en mannitolvrye NP's as gevolg van die ontbinding van mannitolvrye NP's tydens dehidrasie. bespreek.
Dehidrasie word gebruik vir langtermynberging en herverwerking in ander formulerings. Die vermoë van droë NP's om na berging te herkonstitueer, is krities vir hul gebruik in verskillende formulerings soos tablette en films. Ons het opgemerk dat die gemiddelde deeltjiegrootte van die spuitgedroogde insulien-NP's in die afwesigheid van mannitol slegs effens toegeneem het na herkonstitusie. Aan die ander kant het die deeltjiegrootte van die spuitgedroogde en gevriesdroogde insulien-nanopartikels met mannitol aansienlik toegeneem (Tabel 1). PDI en EE is nie beduidend verander nie (p > 0.05) na rekombinasie van alle NP's in hierdie studie (Tabel 1). Hierdie resultaat dui daarop dat die meeste van die deeltjies ongeskonde gebly het na heroplossing. Die byvoeging van mannitol het egter gelei tot 'n aansienlik verminderde insulienlading van gevriesdroogde en spuitgedroogde mannitol-nanopartikels (Tabel 1). In teenstelling hiermee het die insulienladingsinhoud van NP's wat sonder mannitol spuitgedroog is, dieselfde gebly as voorheen (Tabel 1).
Dit is welbekend dat die lading van nanopartikels krities is wanneer dit vir geneesmiddelafleweringsdoeleindes gebruik word. Vir NP's met lae ladings is baie groot hoeveelhede materiaal nodig om die terapeutiese drempel te bereik. Die hoë viskositeit van sulke hoë NP-konsentrasies lei egter tot ongerief en probleme met orale toediening en inspuitbare formulerings, onderskeidelik 22. Daarbenewens kan insulien-NP's ook gebruik word om tablette en viskose biofilms te maak 23, 24, wat die gebruik van groot hoeveelhede NP's teen lae ladingsvlakke vereis, wat lei tot groot tablette en dik biofilms wat nie geskik is vir orale toepassings nie. Daarom is gedehidreerde NP's met 'n hoë insulienlading hoogs wenslik. Ons resultate dui daarop dat die hoë insulienlading van mannitolvrye sproeigedroogde NP's baie aantreklike voordele vir hierdie alternatiewe afleweringsmetodes kan bied.
Alle gedehidreerde NP's is vir drie maande in die yskas gehou. SEM-resultate het getoon dat die morfologie van alle gedehidreerde NP's nie beduidend verander het gedurende die drie maande lange berging nie (Fig. 4). Na herkonstitusie in water het alle NP's 'n effense afname in EE getoon en ongeveer 'n klein hoeveelheid (~5%) insulien vrygestel gedurende die drie maande lange bergingsperiode (Tabel 2). Die gemiddelde deeltjiegrootte van alle nanopartikels het egter toegeneem. Die deeltjiegrootte van NP's wat sonder mannitol gesproeidroog is, het toegeneem tot 525 nm, terwyl dié van gesproeidroogde en gevriesdroogde NP's met mannitol onderskeidelik tot 872 en 921 nm toegeneem het (Tabel 2).
Morfologie van verskillende gedehidreerde insulien-NP's wat vir drie maande gestoor is: (a) SEM-beeld van gevriesdroogde insulien-NP's met mannitol; (b) SEM-beeld van spuitgedroogde insulien-nanopartikels sonder mannitol; (c) sonder mannitol SEM-beelde van spuitgedroogde insulien-NP's.
Verder is neerslae gesien in die gerekonstrueerde insulien-nanopartikels wat met mannitol gesproeidroog en gevriesdroog is (Fig. S2). Dit kan veroorsaak word deur groot deeltjies wat nie behoorlik in die water suspendeer nie. Al die bogenoemde resultate toon dat die sproeidroogtegniek insulien-nanopartikels teen dehidrasie kan beskerm en dat hoë ladings insulien-nanopartikels verkry kan word sonder enige vulstowwe of krioprotekteermiddels.
Insulienretensie is getoets in pH = 2.5 medium met pepsien, tripsien en α-chimotripsien om die beskermende vermoë van NP's teen ensiematiese vertering na dehidrasie te demonstreer. Die insulienretensie van gedehidreerde NP's is vergelyk met dié van vars voorbereide NP's, en vrye insulien is as 'n negatiewe kontrole gebruik. In hierdie studie het vrye insulien vinnige insulieneliminasie binne 4 uur in al drie ensiematiese behandelings getoon (Fig. 5a-c). In teenstelling hiermee het insulieneliminasietoetsing van NP's wat met mannitol gevriesdroog is en NP's wat met of sonder mannitol gespuitdroog is, aansienlik hoër beskerming van hierdie NP's teen ensiematiese vertering getoon, wat soortgelyk was aan dié van vars voorbereide insulien-NP's (figuur 1).5a-c). Met die hulp van nanopartikels in pepsien, tripsien en α-chimotripsien kon meer as 50%, 60% en 75% van insulien onderskeidelik binne 4 uur beskerm word (Fig. 5a-c). Hierdie insulienbeskermende vermoë kan die kans op hoër insulienabsorpsie verhoog. in die bloedstroom25. Hierdie resultate dui daarop dat sproeidroging met of sonder mannitol en vriesdroging met mannitol die insulienbeskermende vermoë van NP's na dehidrasie kan behou.
Beskerming en vrystellingsgedrag van gedehidreerde insulien-NP's: (a) beskerming van insulien in pepsienoplossing; (b) beskerming van insulien in tripsinoplossing; (c) beskerming van insulien deur α-chimotripsinoplossing; (d) Die vrystellingsgedrag van gedehidreerde NP's in pH = 2.5 oplossing; (e) die vrystellingsgedrag van gedehidreerde NP's in pH = 6.6 oplossing; (f) die vrystellingsgedrag van gedehidreerde NP's in pH = 7.0 oplossing.
Vars voorbereide en gerekonstrueerde droë insulien-NP's is in verskeie buffers (pH = 2.5, 6.6, 7.0) by 37 °C geïnkubeer, wat die pH-omgewing van die maag, duodenum en boonste dunderm simuleer, om die effek van insulien op insulienweerstandigheid te ondersoek. Vrystellingsgedrag in verskillende omgewings. Fragment van die spysverteringskanaal. By pH = 2.5 het insulien-gelaaide NP's en heroplosbare droë insulien-NP's 'n aanvanklike barsvrystelling binne die eerste uur getoon, gevolg deur 'n stadige vrystelling oor die volgende 5 uur (Fig. 5d). Hierdie vinnige vrystelling aan die begin is heel waarskynlik die gevolg van vinnige oppervlakdesorpsie van proteïenmolekules wat nie volledig geïmmobiliseer is in die interne struktuur van die deeltjie nie. By pH = 6.5 het insulien-gelaaide NP's en gerekonstrueerde droë insulien-NP's 'n gladde en stadige vrystelling oor 6 uur getoon, aangesien die pH van die toetsoplossing soortgelyk was aan dié van die NP's-voorbereide oplossing (Fig. 5e). By pH = 7 was die NP's onstabiel en het byna heeltemal binne die eerste twee uur ontbind (Fig. 5f). Dit is omdat deprotonering van chitosan by hoër pH plaasvind, wat lei tot 'n minder kompakte polimeernetwerk en vrystelling van gelaaide insulien.
Verder het die insulien-NP's wat sonder mannitol gesproeidroog is, 'n vinniger vrystellingsprofiel getoon as die ander gedehidreerde NP's (Fig. 5d-f). Soos voorheen beskryf, het die gerekonstrueerde insulien-NP's wat sonder mannitol gedroog is, die kleinste deeltjiegrootte getoon. Klein deeltjies bied 'n groter oppervlakarea, dus sal die meeste van die relevante geneesmiddel by of naby die deeltjieoppervlak wees, wat lei tot vinnige geneesmiddelvrystelling26.
Die sitotoksisiteit van NP's is ondersoek deur 'n MTT-toets. Soos getoon in Figuur S4, is gevind dat alle gedehidreerde NP's geen beduidende effek op sel-lewensvatbaarheid het teen konsentrasies van 50-500 μg/ml nie, wat daarop dui dat alle gedehidreerde NP's veilig gebruik kan word om die terapeutiese venster te bereik.
Die lewer is die hooforgaan waardeur insulien sy fisiologiese funksies uitoefen. HepG2-selle is 'n menslike hepatoomsellyn wat algemeen as 'n in vitro hepatosietopnamemodel gebruik word. Hier is HepG2-selle gebruik om sellulêre opname van gedehidreerde NP's te bepaal deur middel van vriesdroog- en spuitdroogmetodes. Sellulêre opname deur konfokale laserskandering met behulp van vloeisitometrie en visie na etlike ure se inkubasie met vrye FITC-insulien teen 'n konsentrasie van 25 μg/ml, vars voorbereide FITC-insulienbelaaide NP's en gedehidreerde FITC-insulienbelaaide NP's teen gelyke insulienkonsentrasies. Kwantitatiewe mikroskopie (CLSM) waarnemings is uitgevoer. Gevriesdroogde NP's sonder mannitol is tydens dehidrasie vernietig en is nie in hierdie toets geëvalueer nie. Die intrasellulêre fluoresensie-intensiteite van vars voorbereide insulienbelaaide NP's, gevriesdroogde NP's met mannitol en spuitdroogde NP's met en sonder mannitol (Fig. 6a) was 4.3, 2.6, 2.4 en 4.1 keer hoër as die vrye NP's. FITC-insulien groep, onderskeidelik (Fig. 6b). Hierdie resultate dui daarop dat ingekapselde insulien sterker is in sellulêre opname as vrye insulien, hoofsaaklik as gevolg van die kleiner grootte van die insulien-gelaaide nanopartikels wat in die studie geproduseer is.
HepG2-selopname na 4 uur inkubasie met vars voorbereide NP's en gedehidreerde NP's: (a) Verspreiding van FITC-insulienopname deur HepG2-selle. (b) Geometriese gemiddelde van fluoresensie-intensiteite geanaliseer deur vloeisitometrie (n = 3), *P < 0.05 in vergelyking met vrye insulien.
Net so het die CLSM-beelde getoon dat die FITC-fluoresensie-intensiteite van vars voorbereide FITC-insulien-gelaaide NP's en FITC-insulien-gelaaide sproeigedroogde NP's (sonder mannitol) baie sterker was as dié van die ander monsters (Fig. 6a). Verder, met die byvoeging van mannitol, het die hoër viskositeit van die oplossing die weerstand teen sellulêre opname verhoog, wat gelei het tot verminderde insulienproliferasie. Hierdie resultate dui daarop dat mannitolvrye sproeigedroogde NP's die hoogste sellulêre opname-doeltreffendheid vertoon het omdat hul deeltjiegrootte kleiner was as dié van gevriesdroogde NP's na heroplossing.
Chitosan (gemiddelde molekulêre gewig 100 KDa, 75–85% gedeasetileerd) is aangekoop van Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Natriumtripolifosfaat (TPP) is aangekoop van VWR (Radnor, Pennsilvanië, VSA). Rekombinante menslike insulien wat in hierdie studie gebruik is, was van Fisher Scientific (Waltham, MA, VSA). Fluoressien-isotiosianaat (FITC)-gemerkte menslike insulien en 4′,6-diamidino-2-fenielindooldihidrochloried (DAPI) is aangekoop van Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Die HepG2-sellyn is verkry van ATCC (Manassas, Virginia, VSA). Alle ander reagense was analitiese of chromatografiese graad.
Berei 'n 1 mg/ml CS-oplossing voor deur dit op te los in dubbelgedistilleerde water (DD-water) wat 0.1% asynsuur bevat. Berei 1 mg/ml oplossings van TPP en insulien voor deur dit onderskeidelik in DD-water en 0.1% asynsuur op te los. Die voor-emulsie is voorberei met 'n polytron PCU-2-110 hoëspoed-homogeniseerder (Brinkmann Ind. Westbury, NY, VSA). Die voorbereidingsproses is soos volg: eerstens word 2 ml TPP-oplossing by 4 ml insulienoplossing gevoeg, en die mengsel word vir 30 minute geroer en volledig gemeng. Daarna is die gemengde oplossing drupsgewys deur 'n spuit onder hoëspoedroering (10 000 rpm) by die CS-oplossing gevoeg. Die mengsels is vir 30 minute onder hoëspoedroering (15 000 rpm) in 'n ysbad gehou, en hulle is tot 'n sekere pH aangepas om kruisgekoppelde insulien-NP's te verkry. Om die deeltjiegrootte van insulien-NP's verder te homogeniseer en te verminder, is hulle vir 'n ... bykomende 30 min in 'n ysbad met behulp van 'n sonde-tipe sonikator (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Duitsland).
Insulien-NPS is getoets vir Z-gemiddelde deursnee, polidispersiteitsindeks (PDI) en zeta-potensiaal met behulp van dinamiese ligverstrooiing (DLS) metings met behulp van 'n Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Oostenryk) deur hulle te verdun in DD-water teen 25°C. Morfologie en grootteverspreiding is gekarakteriseer deur 'n Hitachi H7600 transmissie-elektronmikroskoop (TEM) (Hitachi, Tokio, Japan), en beelde is daarna geanaliseer met behulp van Hitachi-beeldsagteware (Hitachi, Tokio, Japan). Om die inkapselingsdoeltreffendheid (EE) en laaikapasiteit (LC) van insulien-NP's te bepaal, is die NP's in ultrafiltrasiebuise met 'n molekulêre gewigsafsnypunt van 100 kDa gepipetteer en vir 30 minute teen 500 xg gesentrifugeer. Ongekapselde insulien in die filtraat is gekwantifiseer met behulp van 'n Agilent 1100-reeks HPLC-stelsel (Agilent, Santa Clara, Kalifornië, VSA) wat bestaan ​​uit 'n kwaternêre pomp, outo-monsternemer, kolomverwarmer en DAD. detektor. Insulien is geanaliseer deur 'n C18-kolom (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, Agilent, VSA) en opgespoor by 214 nm. Die mobiele fase was asetonitriel en water, wat 0.1% TFA bevat, gradiëntverhoudings van 10/90 tot 100/0, en is vir 10 minute laat loop. Die mobiele fase is gepomp teen 'n vloeitempo van 1.0 ml/min. Die kolomtemperatuur is op 20 °C gestel. Bereken die persentasies van EE en LC met behulp van die vergelykings (1) en Vgl. (2).
Verskeie KS/insulien-verhoudings wat wissel van 2.0 tot 4.0 is getoets om insulien NP te optimaliseer. Verskillende hoeveelhede KS-oplossing is tydens die voorbereiding bygevoeg, terwyl die insulien/TPP-mengsel konstant gehou is. Insulien NP's is voorberei in die pH-reeks van 4.0 tot 6.5 deur die pH van die mengsel noukeurig te beheer nadat alle oplossings (insulien, TPP en KS) bygevoeg is. Die EE en deeltjiegrootte van insulien-nanopartikels is geëvalueer by verskillende pH-waardes en KS/insulien-massaverhoudings om die vorming van insulien NP's te optimaliseer.
Die geoptimaliseerde insulien-NP's is op die aluminiumhouer geplaas en met weefsel bedek en met kleefband vasgedraai. Daarna is die geskroefde houers in 'n Labconco FreeZone-vriesdroër (Labconco, Kansas City, MO, VSA) geplaas, toegerus met 'n bakdroër. Die temperatuur en vakuumdruk is gestel op -10 °C, 0.350 Torr vir die eerste 2 uur, en 0 °C en 0.120 Torr vir die oorblywende 22 uur van die 24 uur om droë insulien-NP's te verkry.
Buchi Mini Spuitdroër B-290 (BÜCHI, Flawil, Switserland) is gebruik om ingekapselde insulien te genereer. Die gekose droogparameters was: temperatuur 100 °C, voervloei 3 L/min, en gasvloei 4 L/min.
Insulien-NP's voor en na dehidrasie is gekarakteriseer met behulp van FTIR-ATR-spektroskopie. Gedehidreerde nanopartikels sowel as vrye insulien en chitosan is geanaliseer met behulp van 'n Spectrum 100 FTIR-spektrofotometer (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, VSA) toegerus met 'n universele ATR-monsternemingsbykomstigheid (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, VSA). Seingemiddeldes is verkry van 16 skanderings teen 'n resolusie van 4 cm2 in die frekwensiebereik van 4000-600 cm2.
Morfologie van droë insulien-NP's is beoordeel deur SEM-beelde van gevriesdroogde en spuitdroogde insulien-NP's wat vasgelê is deur 'n Helios NanoLab 650 Gefokusde Ioonbundel-Skanderende Elektronmikroskoop (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, VSA). Die hoofparameter wat gebruik is, was spanning 5 keV en stroom 30 mA.
Alle gedehidreerde insulien-NP's is heropgelos in dd-water. Deeltjiegrootte, PDI, EE en LC is weer getoets met behulp van dieselfde metode wat vroeër genoem is om hul kwaliteit na dehidrasie te bepaal. Die stabiliteit van anhidroinsulien-NP's is ook gemeet deur die eienskappe van die NP's na langdurige berging te toets. In hierdie studie is alle NP's na dehidrasie vir drie maande in die yskas gestoor. Na drie maande se berging is NP's getoets vir morfologiese deeltjiegrootte, PDI, EE en LC.
Los 5 ml gerekonstrueerde NP's op in 45 ml wat gesimuleerde maagvloeistof (pH 1.2, bevattende 1% pepsien), dermvloeistof (pH 6.8, bevattende 1% tripsin) of chimotripsinoplossing (100 g/ml, in fosfaatbuffer, pH 7.8) bevat om die doeltreffendheid van insulien in die beskerming van NP's na dehidrasie te evalueer. Hulle is by 37°C geïnkubeer met 'n roerspoed van 100 rpm. 500 μL van die oplossing is op verskillende tydspunte versamel en die insulienkonsentrasie is deur HPLC bepaal.
Die in vitro-vrystellingsgedrag van vars voorbereide en gedehidreerde insulien-NP's is getoets deur die dialisesakmetode (molekulêre gewigsafsnypunt 100 kDa, Spectra Por Inc.). Vars voorbereide en gerekonstrueerde droë NP's is in vloeistowwe by pH 2.5, pH 6.6 en pH 7.0 (0.1 M fosfaatgebufferde soutoplossing, PBS) gedialiseer om die pH-omgewing van die maag, duodenum en boonste dunderm onderskeidelik te simuleer. Alle monsters is by 37 °C geïnkubeer met voortdurende skudding teen 200 rpm. Aspireer die vloeistof buite die 5 ml dialisesak op die volgende tye: 0.5, 1, 2, 3, 4 en 6 uur, en vul die volume onmiddellik aan met vars dialisaat. Insulienkontaminasie in die vloeistof is deur HPLC geanaliseer, en die tempo van insulienvrystelling uit die nanopartikels is bereken uit die verhouding van vrye insulien vrygestel tot totale insulien wat in die nanopartikels ingekapsuleer is (Vergelyking 3).
Menslike hepatosellulêre karsinoom-sellyn HepG2-selle is in 60 mm deursnee-skottels gekweek met behulp van Dulbecco se Gemodifiseerde Eagle-medium (DMEM) wat 10% fetale beeserum, 100 IE/ml penisillien en 100 μg/ml streptomisien29 bevat. Kulture is by 37°C, 95% relatiewe humiditeit en 5% CO2 gehou. Vir opname-toetse is HepG2-selle teen 1 × 105 selle/ml op 'n 8-putjie Nunc Lab-Tek kamerskyfiestelsel (Thermo Fisher, NY, VSA) gesaai. Vir sitotoksisiteit-toetse is hulle in 96-putjieplate (Corning, NY, VSA) teen 'n digtheid van 5 × 104 selle/ml gesaai.
Die MTT-toets is gebruik om die sitotoksisiteit van vars voorbereide en gedehidreerde insulien NP's30 te evalueer. HepG2-selle is in 96-putplate gesaai teen 'n digtheid van 5 × 104 selle/ml en vir 7 dae voor toetsing gekweek. Insulien NP's is tot verskillende konsentrasies (50 tot 500 μg/ml) in kultuurmedium verdun en dan aan selle toegedien. Na 24 uur inkubasie is selle 3 keer met PBS gewas en vir 'n bykomende 4 uur met medium wat 0.5 mg/ml MTT bevat, geïnkubeer. Sitotoksisiteit is beoordeel deur die ensiematiese reduksie van geel tetrazolium MTT tot pers formazan teen 570 nm te meet met behulp van 'n Tecan infinite M200 pro spektrofotometerplaatleser (Tecan, Männedorf, Switserland).
Die sellulêre opname-doeltreffendheid van NP's is getoets deur konfokale laserskandeermikroskopie en vloeisitometrie-analise. Elke putjie van die Nunc Lab-Tek kamerskyfiestelsel is behandel met vrye FITC-insulien, FITC-insulien-gelaaide NP's, en 25 μg/mL gedehidreerde FITC-insulien NP's teen dieselfde konsentrasie gerekonstitueer en vir 4 uur geïnkubeer. Selle is 3 keer met PBS gewas en met 4% paraformaldehied gefikseer. Kerne is gekleur met 4',6-diamidino-2-fenielindool (DAPI). Insulienlokalisering is waargeneem met behulp van 'n Olympus FV1000 laserskandeer/twee-foton konfokale mikroskoop (Olympus, Shinjuku City, Tokio, Japan). Vir vloeisitometrie-analise is dieselfde konsentrasies van 10 μg/mL vrye FITC-insulien, FITC-insulien-gelaaide NP's en heroplosbare gedehidreerde FITC-insulien NP's bygevoeg tot 96-putjieplate wat met HepG2-selle gesaai is en vir 4 uur geïnkubeer. ure. Na 4 uur inkubasie is selle verwyder en 3 keer met FBS gewas. 5 × 104 selle per monster is geanaliseer deur 'n BD LSR II vloeisitometer (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Verenigde State).
Alle waardes word uitgedruk as gemiddelde ± standaardafwyking. Vergelykings tussen alle groepe is geassesseer met behulp van eenrigting-ANOVA of t-toets deur IBM SPSS Statistics 26 vir Mac (IBM, Endicott, New York, VSA) en p < 0.05 is as statisties beduidend beskou.
Hierdie studie demonstreer die buigsaamheid en vermoë van sproeidroging om kruisgekoppelde chitosan/TPP/insulien-nanopartikels te dehidreer met beter rekonstitutie in vergelyking met standaard vriesdroogmetodes wat vulmiddel- of kriobeskermende middels gebruik, asook 'n hoër laaikapasiteit. Die geoptimaliseerde insulien-nanopartikels het 'n gemiddelde deeltjiegrootte van 318 nm en 'n inkapselingsdoeltreffendheid van 99.4% opgelewer. SEM- en FTIR-resultate na dehidrasie het getoon dat die sferiese struktuur slegs in sproeigedroogde NP's met en sonder mannitol en gevriesdroog met mannitol behoue ​​gebly het, maar gevriesdroogde NP's sonder mannitol is tydens dehidrasie ontbind. In die rekonstitutievermoëtoets het insulien-nanopartikels wat sonder mannitol gevriesdroog is, die kleinste gemiddelde deeltjiegrootte en die hoogste lading na rekonstitutie getoon. Die vrystellingsgedrag van al hierdie gedehidreerde NP's het getoon dat hulle vinnig vrygestel is in oplossings van pH = 2.5 en pH = 7, en baie stabiel was in oplossings van pH = 6.5. In vergelyking met ander heropgeloste gedehidreerde NP's, het die NP's... Spuitgedroog sonder mannitol het die vinnigste vrystelling getoon. Hierdie resultaat stem ooreen met dié wat in die sellulêre opname-toets waargeneem is, aangesien spuitgedroogde NP's in die afwesigheid van mannitol die sellulêre opname-doeltreffendheid van vars voorbereide NP's byna heeltemal gehandhaaf het. Hierdie resultate dui daarop dat droë insulien-nanopartikels wat deur mannitolvrye spuitdroging voorberei is, die geskikste is vir verdere verwerking in ander watervrye dosisvorme, soos orale tablette of bioklewende films.
As gevolg van intellektuele eiendomskwessies is die datastelle wat tydens die huidige studie gegenereer en/of geanaliseer is, nie publiek beskikbaar nie, maar is op redelike versoek van die onderskeie outeurs beskikbaar.
Kagan, A. Tipe 2-diabetes: sosiale en wetenskaplike oorsprong, mediese komplikasies en implikasies vir pasiënte en ander. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Die ontwikkeling van insulieninkapseling: is orale toediening nou moontlik? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Onlangse vooruitgang in orale insulien-gelaaide liposoom-afleweringstelsels vir die behandeling van diabetes. Interpretasie. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).