Die artikel is deel van die navorsingsonderwerp "Verbetering van die weerstand van peulgewasse teen patogene en plae", bekyk al 5 artikels.
Die veroorsakende agent van die swamsiekte nekrose Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary gebruik 'n veelvlakkige strategie om verskillende gasheerplante te infekteer. Hierdie studie stel die gebruik van die diamien L-ornitien, 'n nie-proteïen aminosuur wat die sintese van ander essensiële aminosure stimuleer, voor as 'n alternatiewe bestuurstrategie om die molekulêre, fisiologiese en biochemiese reaksies van Phaseolus vulgaris L. op witskimmel wat deur Pseudomonas sclerotiorum veroorsaak word, te verbeter. In vitro-eksperimente het getoon dat L-ornitien die miseliale groei van S. pyrenoidosa op 'n dosisafhanklike wyse aansienlik gerem het. Boonop kon dit die erns van witskimmel onder kweekhuistoestande aansienlik verminder. Verder het L-ornitien die groei van die behandelde plante gestimuleer, wat aandui dat die getoetste konsentrasies van L-ornitien nie fitotoksies vir die behandelde plante was nie. Daarbenewens het L-ornitien die uitdrukking van nie-ensiematiese antioksidante (totale oplosbare fenole en flavonoïede) en ensiematiese antioksidante (katalase (CAT), peroksidase (POX) en polifenoloksidase (PPO)) verhoog, en die uitdrukking van drie antioksidantverwante gene (PvCAT1, PvSOD en PvGR) verhoog. Verder het in silico-analise die teenwoordigheid van 'n vermeende oksaloasetaat-asetielhidrolase (SsOAH) proteïen in die S. sclerotiorum-genoom aan die lig gebring, wat baie soortgelyk was aan die oksaloasetaat-asetielhidrolase (SsOAH) proteïene van Aspergillus fijiensis (AfOAH) en Penicillium sp. (PlOAH) in terme van funksionele analise, gekonserveerde domeine en topologie. Interessant genoeg het die byvoeging van L-ornitien tot aartappeldekstrosebouillon (PDB) medium die uitdrukking van die SsOAH-geen in S. sclerotiorum-miselia aansienlik verminder. Net so het eksogene toediening van L-ornitien die uitdrukking van die SsOAH-geen in swammiselia wat van behandelde plante versamel is, aansienlik verminder. Laastens het L-ornitien-toediening oksaalsuurafskeiding in beide PDB-medium en besmette blare aansienlik verminder. Ten slotte speel L-ornitien 'n sleutelrol in die handhawing van die redoksstatus sowel as die verbetering van die verdedigingsreaksie van besmette plante. Die resultate van hierdie studie kan help met die ontwikkeling van innoverende, omgewingsvriendelike metodes om witskimmel te beheer en die impak daarvan op boontjieproduksie en ander gewasse te verminder.
Witskimmel, veroorsaak deur die nekrotrofiese swam Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, is 'n verwoestende, opbrengsverminderende siekte wat 'n ernstige bedreiging vir die wêreldwye boontjieproduksie (Phaseolus vulgaris L.) inhou (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum is een van die moeilikste grondgedraagde swamplantpatogene om te beheer, met 'n breë gasheerreeks van meer as 600 plantspesies en die vermoë om gasheerweefsels vinnig op 'n nie-spesifieke wyse te masereer (Liang en Rollins, 2018). Onder ongunstige toestande ondergaan dit 'n kritieke fase van sy lewensiklus, waar dit vir lang tye dormant bly as swart, harde, saadagtige strukture genaamd 'sklerotia' in die grond of as wit, donsige groeisels in die miselium of stingelmerg van besmette plante (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum is in staat om sklerotia te vorm, wat dit toelaat om vir lang tydperke in besmette lande te oorleef en tydens siektes te voortduur (Schwartz et al., 2005). Sklerotia is ryk aan voedingstowwe, kan vir lang tydperke in die grond voortduur en dien as die primêre inokulum vir daaropvolgende infeksies (Schwartz et al., 2005). Onder gunstige toestande ontkiem sklerotia en produseer luggedraagde spore wat alle bogrondse dele van die plant kan besmet, insluitend maar nie beperk tot blomme, stingels of peule nie (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum gebruik 'n veelvlakkige strategie om sy gasheerplante te infekteer, wat 'n reeks gekoördineerde gebeurtenisse behels, van sklerotiële ontkieming tot simptoomontwikkeling. Aanvanklik produseer S. sclerotiorum gesuspendeerde spore (genoem askospore) van sampioenagtige strukture wat apotesia genoem word, wat in die lug versprei word en ontwikkel tot nie-beweeglike sklerotia op besmette plantreste (Bolton et al., 2006). Die swam skei dan oksaalsuur, 'n virulensiefaktor, af om plantselwand pH te beheer, ensiematiese afbraak en weefselinval te bevorder (Hegedus en Rimmer, 2005), en die gasheerplant se oksidatiewe uitbarsting te onderdruk. Hierdie versuringsproses verswak die plantselwand en bied 'n gunstige omgewing vir die normale en doeltreffende werking van swamselwand-afbrekende ensieme (CWDE's), wat die patogeen toelaat om die fisiese versperring te oorkom en die gasheerweefsels te penetreer (Marciano et al., 1983). Sodra dit gepenetreer is, skei S. sclerotiorum 'n aantal CWDE's af, soos poligalakturonase en sellulase, wat die verspreiding daarvan in besmette weefsels vergemaklik en weefselnekrose veroorsaak. Die progressie van letsels en hifematte lei tot die kenmerkende simptome van witskimmel (Hegedus en Rimmer, 2005). Intussen herken gasheerplante patogeen-geassosieerde molekulêre patrone (PAMP's) deur patroonherkenningsreseptore (PRR's), wat 'n reeks seingebeurtenisse veroorsaak wat uiteindelik verdedigingsreaksies aktiveer.
Ten spyte van dekades se pogings tot siektebeheer, bly daar steeds tekorte aan voldoende weerstandbiedende kiemplasma in boontjies, soos in ander kommersiële gewasse, as gevolg van die weerstand, oorlewing en aanpasbaarheid van die patogeen. Siektebestuur is dus uiters uitdagend en vereis 'n geïntegreerde, veelsydige strategie wat 'n kombinasie van kulturele praktyke, biologiese beheer en chemiese swamdoders insluit (O'Sullivan et al., 2021). Chemiese beheer van witskimmel is die doeltreffendste omdat swamdoders, wanneer dit korrek en op die regte tyd toegedien word, die verspreiding van die siekte effektief kan beheer, die erns van infeksie kan verminder en opbrengsverliese kan verminder. Oorbenutting en oormatige afhanklikheid van swamdoders kan egter lei tot die opkoms van weerstandbiedende stamme van S. sclerotiorum en 'n negatiewe impak hê op nie-teikenorganismes, grondgesondheid en watergehalte (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Daarom het die vind van omgewingsvriendelike alternatiewe 'n topprioriteit geword.
Poliamiene (PA's), soos putressien, spermidien, spermien en kadaverien, kan dien as belowende alternatiewe teen grondgedraagde plantpatogene, waardeur die gebruik van gevaarlike chemiese swamdoders heeltemal of gedeeltelik verminder word (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). In hoër plante is PA's betrokke by baie fisiologiese prosesse, insluitend, maar nie beperk tot, seldeling, differensiasie en reaksie op abiotiese en biotiese stres (Killiny en Nehela, 2020). Hulle kan as antioksidante optree, help om reaktiewe suurstofspesies (ROS) op te ruim, redokshomeostase te handhaaf (Nehela en Killiny, 2023), verdedigingsverwante gene induseer (Romero et al., 2018), verskeie metaboliese weë reguleer (Nehela en Killiny, 2023), endogene fitohormone moduleer (Nehela en Killiny, 2019), sistemiese verworwe weerstand (SAR) vestig, en plant-patogeen-interaksies reguleer (Nehela en Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Dit is opmerklik dat die spesifieke meganismes en rolle van PA's in plantverdediging wissel na gelang van plantspesies, patogene en omgewingstoestande. Die volopste PA in plante word biosintetiseer uit die essensiële poliamien L-ornitien (Killiny en Nehela, 2020).
L-ornitien speel verskeie rolle in plantgroei en -ontwikkeling. Byvoorbeeld, vorige studies het getoon dat ornitien in rys (Oryza sativa) geassosieer kan word met stikstofherwinning (Liu et al., 2018), rysopbrengs, kwaliteit en aroma (Lu et al., 2020), en waterstresreaksie (Yang et al., 2000). Verder het eksogene toediening van L-ornitien die droogtetoleransie in suikerbeet (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) aansienlik verbeter en soutstres in ui (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu en Çavuşoǧlu, 2021) en kasjoeneut (Anacardium occidentale) plante verlig (da Rocha et al., 2012). Die potensiële rol van L-ornitien in abiotiese stresverdediging kan te wyte wees aan die betrokkenheid daarvan by prolien-akkumulasie in behandelde plante. Byvoorbeeld, gene wat verband hou met prolienmetabolisme, soos ornitien delta aminotransferase (delta-OAT) en prolien dehidrogenase (ProDH1 en ProDH2) gene, is voorheen berig as betrokke by die verdediging van Nicotiana benthamiana en Arabidopsis thaliana teen nie-gasheer Pseudomonas syringae stamme (Senthil-Kumar en Mysore, 2012). Aan die ander kant is swam ornitien dekarboksilase (ODC) nodig vir patogeengroei (Singh et al., 2020). Die teiken van ODC van Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici via gasheer-geïnduseerde geenstilmaak (HIGS) het die weerstand van tamatieplante teen Fusarium-verwelking aansienlik verhoog (Singh et al., 2020). Die potensiële rol van eksogene ornitientoediening teen biotiese stresfaktore soos fitopatogene is egter nie goed bestudeer nie. Meer belangrik, die effekte van ornitien op siekteweerstand en die gepaardgaande biochemiese en fisiologiese verskynsels bly grootliks onontgin.
Dit is belangrik om die kompleksiteit van S. sclerotiorum-infeksie van peulgewasse te verstaan ​​vir die ontwikkeling van effektiewe beheerstrategieë. In hierdie studie het ons gepoog om die potensiële rol van die diamien L-ornitien te identifiseer as 'n sleutelfaktor in die verbetering van die verdedigingsmeganismes en weerstand van peulgewasse teen Sclerotinia sclerotiorum-infeksie. Ons hipotetiseer dat, benewens die verbetering van die verdedigingsreaksies van besmette plante, L-ornitien ook 'n sleutelrol speel in die handhawing van die redoksstatus. Ons stel voor dat die potensiële effekte van L-ornitien verband hou met die regulering van ensiematiese en nie-ensiematiese antioksidant-verdedigingsmeganismes en inmenging met swampatogenisiteit/virulensiefaktore en geassosieerde proteïene. Hierdie dubbele funksionaliteit van L-ornitien maak dit 'n belowende kandidaat vir 'n volhoubare strategie om die impak van witskimmel te versag en die weerstand van algemene peulgewasse teen hierdie kragtige swampatogeen te verbeter. Die resultate van die huidige studie kan help met die ontwikkeling van innoverende, omgewingsvriendelike metodes om witskimmel te beheer en die impak daarvan op peulgewasseproduksie te versag.
In hierdie studie is 'n vatbare kommersiële variëteit van gewone boon, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), as eksperimentele materiaal gebruik. Gesonde sade is goedgunstiglik verskaf deur die Peulgewasse-navorsingsdepartement, Veldgewasse-navorsingsinstituut (FCRI), Landbounavorsingsentrum (ARC), Egipte. Vyf sade is in plastiekpotte (binnediameter 35 cm, diepte 50 cm) gesaai, gevul met S. sclerotiorum-besmette grond onder kweekhuistoestande (25 ± 2 °C, relatiewe humiditeit 75 ± 1%, 8 uur lig/16 uur donker). 7–10 dae na saai (DPS) is die saailinge uitgedun om slegs twee saailinge met eenvormige groei en drie volledig uitgegroeide blare in elke pot te laat. Alle potplante is een keer elke twee weke natgemaak en maandeliks bemes teen die aanbevole dosis vir die gegewe variëteit.
Om 'n konsentrasie van 500 mg/L L-ornitiendiamien (ook bekend as (+)-(S)-2,5-diaminopentaansuur; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Duitsland) voor te berei, is 50 mg eers in 100 mL steriele gedistilleerde water opgelos. Die voorraadoplossing is toe verdun en in daaropvolgende eksperimente gebruik. Kortliks, ses reekse L-ornitienkonsentrasies (12.5, 25, 50, 75, 100 en 125 mg/L) is in vitro getoets. Daarbenewens is steriele gedistilleerde water as 'n negatiewe kontrole (Mock) gebruik en die kommersiële swamdoder "Rizolex-T" 50% benatbare poeier (toklofos-metiel 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egipte) is as 'n positiewe kontrole gebruik. Die kommersiële swamdoder “Rizolex-T” is in vitro getoets teen vyf konsentrasies (2, 4, 6, 8 en 10 mg/L).
Monsters van gewone boontjiestingels en -peule wat tipiese simptome van witskimmel toon (besmettingskoers: 10–30%) is van kommersiële plase versamel. Alhoewel die meeste van die besmette plantmateriaal volgens spesie/variëteit geïdentifiseer is (vatbare kommersiële variëteit Giza 3), was ander, veral dié wat van plaaslike markte verkry is, van onbekende spesies. Die versamelde besmette materiaal is eers vir 3 minute met 'n 0.5% natriumhipochlorietoplossing ontsmet, daarna verskeie kere met steriele gedistilleerde water afgespoel en met steriele filterpapier drooggevee om oortollige water te verwyder. Die besmette organe is toe in klein stukkies van die middelste weefsel (tussen gesonde en besmette weefsels) gesny, op aartappeldekstrose-agar (PDA)-medium gekweek en by 25 ± 2 °C met 'n 12 uur lig/12 uur donker siklus vir 5 dae geïnkubeer om sklerotia-vorming te stimuleer. Die miseliumpuntmetode is ook gebruik om swam-isolate van gemengde of besmette kulture te suiwer. Die gesuiwerde swam-isolaat is eers geïdentifiseer op grond van sy kulturele morfologiese eienskappe en toe bevestig as S. sclerotiorum op grond van mikroskopiese kenmerke. Laastens is alle gesuiwerde isolate vir patogenisiteit op die vatbare gewone boontjiekultivar Giza 3 getoets om aan Koch se postulate te voldoen.
Daarbenewens is die mees indringende S. sclerotiorum-isolaat (isolaat #3) verder bevestig gebaseer op interne getranskribeerde spasieerder (ITS) volgordebepaling soos beskryf deur White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Kortliks, isolate is gekweek in aartappeldekstrose-aftreksel (PDB) en geïnkubeer by 25 ± 2 °C vir 5-7 dae. Swammiselium is toe versamel, deur kaasdoek gefiltreer, twee keer met steriele water gewas en met steriele filterpapier gedroog. Genomiese DNS is geïsoleer met behulp van die Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Die ITS rDNA-streek is toe geamplifiseer met behulp van die spesifieke primerpaar ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; verwagte grootte: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Die gesuiwerde PCR-produkte is vir volgordebepaling ingedien (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Die ITS rDNA-reekse is bidireksioneel georden met behulp van die Sanger-volgordebepalingsmetode. Die saamgestelde navraagreekse is toe vergelyk met die nuutste data in GenBank en die National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) met behulp van BLASTn-sagteware. Die navraagreeks is vergelyk met 20 ander S. sclerotiorum-stamme/isolate wat verkry is uit die nuutste data in NCBI GenBank (Aanvullende Tabel S1) met behulp van ClustalW in die Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; weergawe 11) (Kumar et al., 2024). Evolusionêre analise is uitgevoer met behulp van die maksimum waarskynlikheidsmetode en die algemene tyd-omkeerbare nukleotiedsubstitusiemodel (Nei en Kumar, 2000). Die boom met die hoogste log-waarskynlikheid word getoon. Die aanvanklike boom vir die heuristiese soektog word gekies deur die boom met die hoër log-waarskynlikheid te kies tussen die neighbor-joining (NJ) boom (Kumar et al., 2024) en die maksimum parsimonie (MP) boom. Die NJ-boom is gekonstrueer met behulp van 'n paarsgewyse afstandsmatriks wat bereken is met behulp van die algemene tyd-omkeerbare model (Nei en Kumar, 2000).
Die antibakteriese aktiwiteit van L-ornitien en die bakteriedoder "Rizolex-T" is in vitro bepaal deur die agar-diffusiemetode. Metode: Neem die toepaslike hoeveelheid van die voorraadoplossing van L-ornitien (500 mg/L) en meng dit deeglik met 10 ml van die PDA-voedingsmedium om oplossings met finale konsentrasies van onderskeidelik 12.5, 25, 50, 75, 100 en 125 mg/L voor te berei. Vyf konsentrasies van die swamdoder "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 en 10 mg/L) en steriele gedistilleerde water is as 'n kontrole gebruik. Nadat die medium gestol het, is 'n vars voorbereide miseliumprop van Sclerotinia sclerotiorum-kultuur, 4 mm in deursnee, na die middel van die Petri-bakkie oorgedra en by 25±2°C gekweek totdat die miselium die hele kontrole-Petri-bakkie bedek het, waarna die swamgroei aangeteken is. Bereken die persentasie inhibisie van radiale groei van S. sclerotiorum met behulp van vergelyking 1:
Die eksperiment is twee keer herhaal, met ses biologiese replikate vir elke kontrole-/eksperimentele groep en vyf potte (twee plante per pot) vir elke biologiese replikaat. Elke biologiese replikaat is twee keer geanaliseer (twee tegniese replikate) om die akkuraatheid, betroubaarheid en herhaalbaarheid van die eksperimentele resultate te verseker. Daarbenewens is probit-regressie-analise gebruik om die halfmaksimale inhiberende konsentrasie (IC50) en IC99 te bereken (Prentice, 1976).
Om die potensiaal van L-ornitien onder kweekhuistoestande te evalueer, is twee opeenvolgende pot-eksperimente uitgevoer. Kortliks, potte is gevul met gesteriliseerde klei-sandgrond (3:1) en ingeënt met 'n vars voorbereide kultuur van S. sclerotiorum. Eerstens is die mees indringende isolaat van S. sclerotiorum (isolaat #3) gekweek deur een sklerotium in die helfte te sny, dit met die gesig na onder op 'n PDA te plaas en dit vir 4 dae by 25°C in konstante donkerte (24 uur) te inkubeer om miseliumgroei te stimuleer. Vier agarproppe met 'n deursnee van 5 mm is toe van die voorrand geneem en met 100 g van 'n steriele mengsel van koring- en ryssemels (1:1, v/v) ingeënt en alle flesse is vir 5 dae by 25 ± 2 °C onder 'n 12 uur lig/12 uur donker siklus geïnkubeer om sklerotiavorming te stimuleer. Die inhoud van alle flesse is deeglik gemeng om homogeniteit te verseker voordat grond bygevoeg is. Daarna is 100 g van die koloniserende semelsmengsel by elke pot gevoeg om 'n konstante konsentrasie patogene te verseker. Die geënte potte is natgemaak om swamgroei te aktiveer en vir 7 dae in kweekhuistoestande geplaas.
Vyf sade van die Giza 3-variëteit is toe in elke pot gesaai. Vir die potte wat met L-ornitien en die swamdoder Rizolex-T behandel is, is die gesteriliseerde sade eers vir twee uur in 'n waterige oplossing van die twee verbindings met 'n finale IC99-konsentrasie van onderskeidelik ongeveer 250 mg/L en 50 mg/L geweek en toe vir een uur voor saai in die lug gedroog. Aan die ander kant is die sade in steriele gedistilleerde water geweek as 'n negatiewe kontrole. Na 10 dae, voor die eerste natmaak, is die saailinge uitgedun, wat slegs twee netjiese saailinge in elke pot oorgelaat het. Daarbenewens, om infeksie met S. sclerotiorum te verseker, is boontjieplantstingels in dieselfde ontwikkelingsstadium (10 dae) op twee verskillende plekke gesny met behulp van 'n gesteriliseerde skalpel en ongeveer 0.5 g van die koloniserende semelsmengsel is in elke wond geplaas, gevolg deur hoë humiditeit om infeksie en siekte-ontwikkeling in alle geënte plante te stimuleer. Kontroleplante is soortgelyk gewond en 'n gelyke hoeveelheid (0.5 g) steriele, ongekoloniseerde semelsmengsel is in die wond geplaas en onder hoë humiditeit gehou om die omgewing vir siekte-ontwikkeling te simuleer en konsekwentheid tussen behandelingsgroepe te verseker.
Behandelingsmetode: Boontjiesaailinge is natgemaak met 500 ml van 'n waterige oplossing van L-ornitien (250 mg/l) of die swamdoder Rizolex-T (50 mg/l) deur die grond te besproei, waarna die behandeling drie keer herhaal is met 'n tussenpose van 10 dae. Die placebo-behandelde kontroles is natgemaak met 500 ml steriele gedistilleerde water. Alle behandelings is onder kweekhuistoestande uitgevoer (25 ± 2°C, 75 ± 1% relatiewe humiditeit, en 'n fotoperiode van 8 uur lig/16 uur donker). Alle potte is tweeweekliks natgemaak en maandeliks behandel met 'n gebalanseerde NPK-kunsmis (20-20-20, met 3.6% swael en TE-mikroelemente; Zain Seeds, Egipte) teen 'n konsentrasie van 3-4 g/l deur blaarbespuiting volgens die aanbevelings vir die spesifieke variëteit en die vervaardiger se instruksies. Tensy anders vermeld, is volledig uitgebreide volwasse blare (2de en 3de blare van bo) 72 uur na behandeling (hpt) van elke biologiese replikaat versamel, gehomogeniseer, saamgevoeg en by -80 °C gestoor vir verdere ontledings, insluitend, maar nie beperk tot, in situ histochemiese lokalisering van oksidatiewe stres-aanwysers, lipiedperoksidasie, ensiematiese en nie-ensiematiese antioksidante en geen-ekspressie.
Die intensiteit van witskimmelinfeksie is weekliks 21 dae na inenting (dpi) bepaal met behulp van 'n skaal van 1–9 (Aanvullende Tabel S2) gebaseer op die Petzoldt en Dickson-skaal (1996) gewysig deur Teran et al. (2006). Kortliks, die stingels en takke van boontjieplante is ondersoek vanaf die punt van inenting om die progressie van letsels langs internodes en nodusse te volg. Die afstand van die letsel vanaf die punt van inenting tot die verste punt langs die stam of tak is toe gemeet en 'n telling van 1–9 is toegeken gebaseer op die ligging van die letsel, waar (1) geen sigbare infeksie naby die punt van inenting aandui nie en (2–9) 'n geleidelike toename in letselgrootte en progressie langs nodusse/internodes aandui (Aanvullende Tabel S2). Die intensiteit van witskimmelinfeksie is toe omgeskakel na persentasie met behulp van formule 2:
Daarbenewens is die area onder die siekteprogressiekurwe (AUDPC) bereken met behulp van die formule (Shaner en Finney, 1977), wat onlangs aangepas is vir witvrot van gewone boontjies (Chauhan et al., 2020) met behulp van vergelyking 3:
Waar Yi = siekte-ernst op tyd ti, Yi+1 = siekte-ernst op volgende tyd ti+1, ti = tyd van eerste meting (in dae), ti+1 = tyd van volgende meting (in dae), n = totale aantal tydspunte of waarnemingspunte. Boontjieplantgroeiparameters, insluitend planthoogte (cm), aantal takke per plant en aantal blare per plant, is weekliks vir 21 dae in alle biologiese replikate aangeteken.
In elke biologiese replikaat is blaarmonsters (tweede en derde volledig ontwikkelde blare van bo af) op dag 45 na behandeling (15 dae na die laaste behandeling) versamel. Elke biologiese replikaat het uit vyf potte bestaan ​​(twee plante per pot). Ongeveer 500 mg van die gebreekte weefsel is gebruik vir die ekstraksie van fotosintetiese pigmente (chlorofil a, chlorofil b en karotenoïede) met behulp van 80% asetoon by 4 °C in die donker. Na 24 uur is die monsters gesentrifugeer en die supernatant is versamel vir die bepaling van chlorofil a, chlorofil b en karotenoïedinhoud kolorimetries met behulp van 'n UV-160A spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan) volgens die metode van (Lichtenthaler, 1987) deur die absorbansie by drie verskillende golflengtes (A470, A646 en A663 nm) te meet. Laastens is die inhoud van fotosintetiese pigmente bereken met behulp van die volgende formules 4-6 wat deur Lichtenthaler (1987) beskryf word.
72 uur na behandeling (hpt) is blare (tweede en derde volledig ontwikkelde blare van bo af) van elke biologiese replikaat versamel vir in situ histochemiese lokalisering van waterstofperoksied (H2O2) en superoksied-anioon (O2•−). Elke biologiese replikaat het uit vyf potte bestaan ​​(twee plante per pot). Elke biologiese replikaat is in duplikaat geanaliseer (twee tegniese replikate) om die akkuraatheid, betroubaarheid en reproduceerbaarheid van die metode te verseker. H2O2 en O2•− is bepaal deur onderskeidelik 0.1% 3,3′-diaminobensidien (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Duitsland) of nitrobloutetrasolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Duitsland) te gebruik, volgens die metodes wat deur Romero-Puertas et al. (2004) en Adam et al. (1989) beskryf is met geringe wysigings. Vir histochemiese lokalisering van H2O2 in situ, is die blaartjies vakuumgeïnfiltreer met 0.1% DAB in 10 mM Tris-buffer (pH 7.8) en toe by kamertemperatuur vir 60 minute in die lig geïnkubeer. Die blaartjies is gebleik in 0.15% (v/v) TCA in 4:1 (v/v) etanol:chloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kaïro, Egipte) en toe aan lig blootgestel totdat hulle donkerder geword het. Net so is kleppe vakuumgeïnfiltreer met 10 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 7.8) wat 0.1 g/v % HBT bevat vir histochemiese lokalisering van O2•− in situ. Die blaartjies is vir 20 minute in die lig by kamertemperatuur geïnkubeer, toe soos hierbo gebleik, en toe verlig totdat donkerblou/violet kolle verskyn het. Die intensiteit van die gevolglike bruin (as 'n H2O2-indikator) of blouviolet (as 'n O2•−-indikator) kleur is bepaal met behulp van die Fidji-weergawe van die beeldverwerkingspakket ImageJ (http://fiji.sc; verkry op 7 Maart 2024).
Malondialdehied (MDA; as 'n merker van lipiedperoksidasie) is bepaal volgens die metode van Du en Bramlage (1992) met geringe wysigings. Blare van elke biologiese replikaat (tweede en derde volledig ontwikkelde blare van bo af) is 72 uur na behandeling (hpt) versamel. Elke biologiese replikaat het vyf potte ingesluit (twee plante per pot). Elke biologiese replikaat is in duplikaat geanaliseer (twee tegniese replikate) om die akkuraatheid, betroubaarheid en reproduceerbaarheid van die metode te verseker. Kortliks, 0.5 g gemaalde blaarweefsel is gebruik vir MDA-ekstraksie met 20% trichloorasynsuur (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, VSA) wat 0.01% gebutileerde hidroksietolueen (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VSA) bevat. Die MDA-inhoud in die supernatant is toe kolorimetries bepaal deur die absorbansie by 532 en 600 nm te meet met behulp van 'n UV-160A spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan) en toe uitgedruk as nmol g−1 FW.
Vir die assessering van nie-ensiematiese en ensiematiese antioksidante, is blare (tweede en derde volledig ontwikkelde blare van bo af) van elke biologiese replikaat 72 uur na behandeling (hpt) versamel. Elke biologiese replikaat het uit vyf potte bestaan ​​(twee plante per pot). Elke biologiese monster is in duplikaat geanaliseer (twee tegniese monsters). Twee blare is met vloeibare stikstof gemaal en direk gebruik vir die bepaling van ensiematiese en nie-ensiematiese antioksidante, totale aminosure, prolieninhoud, geenekspressie en oksalaatkwantifisering.
Totale oplosbare fenole is bepaal met behulp van die Folin-Ciocalteu-reagens (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VSA) met geringe wysigings van die metode wat deur Kahkonen et al. (1999) beskryf is. Kortliks, ongeveer 0.1 g gehomogeniseerde blaarweefsel is vir 24 uur met 20 ml 80% metanol in die donker geëkstraheer en die supernatant is na sentrifugering versamel. 0.1 ml van die monsterekstrak is gemeng met 0.5 ml Folin-Ciocalteu-reagens (10%), vir 30 sekondes geskud en vir 5 minute in die donker gelaat. Daarna is 0.5 ml 20% natriumkarbonaatoplossing (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kaïro, Egipte) by elke buis gevoeg, deeglik gemeng en vir 1 uur by kamertemperatuur in die donker geïnkubeer. Na inkubasie is die absorbansie van die reaksiemengsel by 765 nm gemeet met behulp van 'n UV-160A-spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Die konsentrasie van totale oplosbare fenole in die monsterekstrakte is bepaal met behulp van 'n gallussuurkalibrasiekurwe (Fisher Scientific, Hampton, NH, VSA) en uitgedruk as milligram gallussuurekwivalent per gram vars gewig (mg GAE g-1 vars gewig).
Die totale oplosbare flavonoïedinhoud is bepaal volgens die metode van Djeridane et al. (2006) met geringe wysigings. Kortliks, 0.3 ml van die bogenoemde metanol-ekstrak is gemeng met 0.3 ml van 'n 5% aluminiumchloriedoplossing (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, VSA), kragtig geroer en dan vir 5 minute by kamertemperatuur geïnkubeer, gevolg deur die byvoeging van 0.3 ml van 'n 10% kaliumasetaatoplossing (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kaïro, Egipte), deeglik gemeng en vir 30 minute by kamertemperatuur in die donker geïnkubeer. Na inkubasie is die absorbansie van die reaksiemengsel by 430 nm gemeet met behulp van 'n UV-160A spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Die konsentrasie van totale oplosbare flavonoïede in monsterekstrakte is bepaal met behulp van 'n rutinkalibrasiekurwe (TCI America, Portland, OR, VSA) en dan uitgedruk as milligram rutin-ekwivalent per gram vars gewig (mg RE g-1 vars gewig).
Die totale vrye aminosuurinhoud van boontjieblare is bepaal met behulp van 'n gemodifiseerde ninhidrienreagens (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, VSA) gebaseer op die metode wat deur Yokoyama en Hiramatsu (2003) voorgestel is en deur Sun et al. (2006) gewysig is. Kortliks, 0.1 g gemaalde weefsel is met pH 5.4 buffer onttrek, en 200 μL van die supernatant is met 200 μL ninhidrien (2%) en 200 μL piridien (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, VSA gereageer, vir 30 minute in 'n kookwaterbad geïnkubeer, dan afgekoel en by 580 nm gemeet met behulp van 'n UV-160A spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Aan die ander kant is prolien bepaal deur die Bates-metode (Bates et al., 1973). Prolien is geëkstraheer met 3% sulfosalisielsuur (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, VSA) en na sentrifugering is 0.5 ml van die supernatant gemeng met 1 ml ysasynsuur (Fisher Scientific, Hampton, NH, VSA) en ninhidrienreagens, geïnkubeer by 90°C vir 45 min, afgekoel en gemeet by 520 nm met behulp van dieselfde spektrofotometer as hierbo. Totale vrye aminosure en prolien in die blaarekstrakte is bepaal deur gebruik te maak van glisien- en prolienkalibrasiekurwes (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, VSA), onderskeidelik, en uitgedruk as mg/g vars gewig.
Om die ensiematiese aktiwiteit van antioksidantensieme te bepaal, is ongeveer 500 mg gehomogeniseerde weefsel geëkstrak met 3 ml 50 mM Tris-buffer (pH 7.8) wat 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VSA) en 7.5% polivinielpirrolidoon (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VSA) bevat, gesentrifugeer teen 10 000 × g vir 20 min onder verkoeling (4 °C), en die supernatant (ru-ensiemekstrak) is versamel (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Katalase (KAT) is toe gereageer met 2 ml van 0.1 M natriumfosfaatbuffer (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VSA) en 100 μl van 269 mM H2O2-oplossing om die ensiematiese aktiwiteit daarvan te bepaal volgens die metode van Aebi (1984) met geringe wysigings (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Guaiakol-afhanklike peroksidase (POX) ensiematiese aktiwiteit is bepaal met behulp van die metode van Harrach et al. (2009). (2008) met geringe wysigings (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) en die ensiematiese aktiwiteit van polifenoloksidase (PPO) is bepaal na reaksie met 2.2 ml van 100 mM natriumfosfaatbuffer (pH 6.0), 100 μl guaiakol (TCI chemicals, Portland, OR, VSA) en 100 μl van 12 mM H2O2. Die metode is effens gewysig vanaf (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Die toets is uitgevoer na reaksie met 3 ml katekoloplossing (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, VSA) (0.01 M) vars voorberei in 0.1 M fosfaatbuffer (pH 6.0). KAT-aktiwiteit is gemeet deur die ontbinding van H2O2 by 240 nm (A240) te monitor, POX-aktiwiteit is gemeet deur die toename in absorbansie by 436 nm (A436) te monitor, en PPO-aktiwiteit is gemeet deur absorbansieskommelings by 495 nm (A495) elke 30 sekondes vir 3 minute op te neem met behulp van 'n UV-160A-spektrofotometer (Shimadzu, Japan).
Real-time RT-PCR is gebruik om die transkripsievlakke van drie antioksidant-verwante gene, insluitend peroksisomale katalase (PvCAT1; GenBank Toegangsnr. KF033307.1), superoksied dismutase (PvSOD; GenBank Toegangsnr. XM_068639556.1), en glutatioonreduktase (PvGR; GenBank Toegangsnr. KY195009.1), in boontjieblare (die tweede en derde volledig ontwikkelde blare van bo af) 72 uur na die laaste behandeling op te spoor. Kortliks, RNA is geïsoleer met behulp van die Simply P Total RNA Extraction Kit (Kat. Nr. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) volgens die vervaardiger se protokol. Daarna is cDNA gesintetiseer met behulp van die TOP script™ cDNA Synthesis Kit volgens die vervaardiger se instruksies. Die primervolgordes van die bogenoemde drie gene word in Aanvullende Tabel S3 gelys. PvActin-3 (GenBank-toegangsnommer: XM_068616709.1) is as die huishoudingsgeen gebruik en die relatiewe geenekspressie is bereken met behulp van die 2-ΔΔCT-metode (Livak en Schmittgen, 2001). Aktienstabiliteit onder biotiese stres (onversoenbare interaksie tussen algemene peulgewasse en die antraknose-swam Colletotrichum lindemuthianum) en abiotiese stres (droogte, soutgehalte, lae temperatuur) is gedemonstreer (Borges et al., 2012).
Ons het aanvanklik 'n genoomwye in silico-analise van oksaloasetaat-asetielhidrolase (OAH) proteïene in S. sclerotiorum uitgevoer met behulp van die proteïen-proteïen BLAST-instrument (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Kortliks, ons het OAH van Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taksied: 1191702; GenBank-toegangsnommer XP_040799428.1; 342 aminosure) en Penicillium lagena (PlOAH; taksied: 94218; GenBank-toegangsnommer XP_056833920.1; 316 aminosure) as navraagreekse gebruik om die homoloë proteïen in S. sclerotiorum (taksied: 5180) te karteer. BLASTp is uitgevoer teen die mees onlangs beskikbare S. sclerotiorum genoomdata in GenBank op die Nasionale Sentrum vir Biotegnologie-inligting (NCBI) webwerf, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Daarbenewens is die voorspelde OAH-geen van S. sclerotiorum (SsOAH) en die evolusionêre analise en filogenetiese boom van AfOAH van A. fijiensis CBS 313.89 en PlOAH van P. lagena afgelei deur die maksimum waarskynlikheidsmetode in MEGA11 (Tamura et al., 2021) en die JTT-matriksgebaseerde model (Jones et al., 1992) te gebruik. Die filogenetiese boom is gekombineer met die veelvuldige belyningsanalise van proteïenvolgordes van alle voorspelde OAH-gene (SsOAH) van S. sclerotiorum en die navraagvolgorde met behulp van die Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos en Agarwala, 2007). Daarbenewens is die beste ooreenstemmende aminosuurvolgordes van SsOAH van S. sclerotiorum in lyn gebring met die navraagvolgordes (AfOAH en PlOAH) (Larkin et al., 2007) deur gebruik te maak van ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), en gekonserveerde streke in die belyning is gevisualiseer met behulp van die ESPript-instrument (weergawe 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Verder is die voorspelde funksionele verteenwoordigende domeine en gekonserveerde plekke van S. sclerotiorum SsOAH interaktief in verskillende families geklassifiseer met behulp van die InterPro-instrument (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Laastens is driedimensionele (3D) struktuurmodellering van die voorspelde S. sclerotiorum SsOAH uitgevoer met behulp van die Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2-bediener weergawe 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) en gevalideer met behulp van die SWISS-MODEL-bediener (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Die voorspelde driedimensionele strukture (PDB-formaat) is interaktief gevisualiseer met behulp van die UCSF-Chimera-pakket (weergawe 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Kwantitatiewe intydse fluoresensie-PCR is gebruik om die transkripsievlak van oksaloasetaat-asetielhidrolase (SsOAH; GenBank-toegangsnommer: XM_001590428.1) in die miselia van Sclerotinia sclerotiorum te bepaal. Kortliks, S. sclerotiorum is in 'n fles wat PDB bevat, ingeënt en in 'n skudinkubeerder (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, VSA) by 25 ± 2 °C vir 24 uur teen 150 rpm en in konstante donkerte (24 uur) geplaas om miseliale groei te stimuleer. Daarna is die selle behandel met L-ornitien en die swamdoder Rizolex-T teen finale IC50-konsentrasies (ongeveer 40 en 3.2 mg/L, onderskeidelik) en toe vir nog 24 uur onder dieselfde toestande gekweek. Na inkubasie is die kulture vir 5 minute teen 2500 rpm gesentrifugeer en die supernatant (swammiselium) is vir geenekspressie-analise versamel. Net so is swammiselium versamel by 0, 24, 48, 72, 96 en 120 uur na infeksie van besmette plante wat witskimmel en wattige miselium op die oppervlak van besmette weefsels gevorm het. RNA is uit die swammiselium onttrek en daarna is cDNA gesintetiseer soos hierbo beskryf. Die primervolgordes vir SsOAH word in Aanvullende Tabel S3 gelys. SsActin (GenBank-toegangsnommer: XM_001589919.1) is as die huishoudingsgeen gebruik, en relatiewe geenekspressie is bereken met behulp van die 2-ΔΔCT-metode (Livak en Schmittgen, 2001).
Oksaalsuur is bepaal in aartappeldekstrose-aftreksel (PDB) en plantmonsters wat die swampatogeen Sclerotinia sclerotiorum bevat volgens die metode van Xu en Zhang (2000) met geringe wysigings. Kortliks, S. sclerotiorum-isolate is in flesse wat PDB bevat, ingeënt en dan in 'n skudinkubeerder (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, VSA) by 150 rpm by 25 ± 2 °C vir 3-5 dae in konstante donkerte (24 uur) gekweek om miseliumgroei te stimuleer. Na inkubasie is die swamkultuur eers deur Whatman #1-filterpapier gefiltreer en dan vir 5 minute by 2500 rpm gesentrifugeer om oorblywende miselium te verwyder. Die supernatant is versamel en by 4 °C gestoor vir verdere kwantitatiewe bepaling van oksalaat. Vir die voorbereiding van plantmonsters is ongeveer 0.1 g plantweefselfragmente drie keer met gedistilleerde water (2 ml elke keer) onttrek. Die monsters is toe vir 5 minute teen 2500 rpm gesentrifugeer, die supernatant is droog gefiltreer deur Whatman No. 1 filterpapier en versamel vir verdere analise.
Vir kwantitatiewe analise van oksaalsuur is die reaksiemengsel in 'n glaspropbuis in die volgende volgorde voorberei: 0.2 ml monster (of PDB-kultuurfiltraat of oksaalsuurstandaardoplossing), 0.11 ml bromofenolblou (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, VSA), 0.198 ml 1 M swaelsuur (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kaïro, Egipte) en 0.176 ml 100 mM kaliumdichromaat (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, VSA), en daarna is die oplossing met gedistilleerde water tot 4.8 ml verdun, kragtig gemeng en onmiddellik in 'n 60 °C waterbad geplaas. Na 10 min is die reaksie gestop deur 0.5 ml natriumhidroksiedoplossing (NaOH; 0.75 M) by te voeg. Die absorbansie (A600) van die reaksiemengsel is gemeet teen 600 nm met behulp van 'n UV-160 spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). PDB en gedistilleerde water is as kontroles gebruik vir die kwantifisering van kultuurfiltrate en plantmonsters, onderskeidelik. Die oksaalsuurkonsentrasies in die kultuurfiltrate, uitgedruk as mikrogram oksaalsuur per milliliter PDB-medium (μg.mL−1), en in die blaarekstrakte, uitgedruk as mikrogram oksaalsuur per gram vars gewig (μg.g−1 FW), is bepaal met behulp van 'n oksaalsuurkalibrasiekurwe (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, VSA).
Dwarsdeur die studie is alle eksperimente ontwerp in 'n volledig gerandomiseerde ontwerp (CRD) met ses biologiese replikate per behandeling en vyf potte per biologiese replikaat (twee plante per pot) tensy anders vermeld. Biologiese replikate is in duplikaat geanaliseer (twee tegniese replikate). Tegniese replikate is gebruik om die reproduceerbaarheid van dieselfde eksperiment te kontroleer, maar is nie in die statistiese analise gebruik om vals replikate te vermy nie. Data is statisties geanaliseer met behulp van variansie-analise (ANOVA) gevolg deur die Tukey-Kramer eerlik betekenisvolle verskil (HSD) toets (p ≤ 0.05). Vir in vitro eksperimente is IC50- en IC99-waardes bereken met behulp van die probit-model en 95%-vertrouensintervalle is bereken.
'n Totaal van vier isolate is versamel van verskillende sojaboonlande in El Ghabiya-goewernement, Egipte. Op PDA-medium het alle isolate romerige wit miselium geproduseer wat vinnig katoenwit geword het (Figuur 1A) en dan beige of bruin in die sklerotiumstadium. Sklerotia is gewoonlik dig, swart, sferies of onreëlmatig van vorm, 5,2 tot 7,7 mm lank en 3,4 tot 5,3 mm in deursnee (Figuur 1B). Alhoewel vier isolate 'n marginale patroon van sklerotia aan die rand van die kultuurmedium ontwikkel het na 10-12 dae van inkubasie by 25 ± 2 °C (Fig. 1A), was die aantal sklerotia per plaat beduidend verskillend tussen hulle (P < 0,001), met isolaat 3 wat die hoogste aantal sklerotia het (32,33 ± 1,53 sklerotia per plaat; Fig. 1C). Net so het isolaat #3 meer oksaalsuur in PDB geproduseer as ander isolate (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Fig. 1D). Isolaat #3 het tipiese morfologiese en mikroskopiese eienskappe van die fitopatogeniese swam Sclerotinia sclerotiorum getoon. Byvoorbeeld, op PDA het kolonies van isolaat #3 vinnig gegroei, was roomwit (Figuur 1A), omgekeerde beige of ligte salmgeelbruin, en het 6-7 dae by 25 ± 2°C benodig om die oppervlak van 'n plaat met 'n deursnee van 9 cm heeltemal te bedek. Gebaseer op die bogenoemde morfologiese en mikroskopiese eienskappe, is isolaat #3 geïdentifiseer as Sclerotinia sclerotiorum.
Figuur 1. Eienskappe en patogenisiteit van S. sclerotiorum-isolate van algemene peulgewasse. (A) Miseliale groei van vier S. sclerotiorum-isolate op PDA-medium, (B) sklerotia van vier S. sclerotiorum-isolate, (C) aantal sklerotia (per plaat), (D) oksaalsuurafskeiding op PDB-medium (μg.mL−1), en (E) siekte-ernst (%) van vier S. sclerotiorum-isolate op vatbare kommersiële peulgewassekultivar Giza 3 onder kweekhuistoestande. Waardes verteenwoordig die gemiddelde ± SD van vyf biologiese replikate (n = 5). Verskillende letters dui statisties beduidende verskille tussen behandelings aan (p < 0.05). (F–H) Tipiese witskimmelsimptome het onderskeidelik op bogrondse stingels en silikate verskyn, 10 dae na inenting met isolaat #3 (dpi). (I) Evolusionêre analise van die interne getranskribeerde spasieerder (ITS) streek van S. sclerotiorum isolaat #3 is uitgevoer met behulp van die maksimum waarskynlikheidsmetode en vergelyk met 20 verwysingsisolate/stamme verkry uit die Nasionale Sentrum vir Biotegnologie-inligting (NCBI) databasis (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Die getalle bokant die groeperingslyne dui die streekdekking (%) aan, en die getalle onder die groeperingslyne dui die taklengte aan.
Verder, om die patogenisiteit te bevestig, is vier verkrygde S. sclerotiorum-isolate gebruik om die vatbare kommersiële boontjiekultivar Giza 3 onder kweekhuistoestande te inokuleer, wat ooreenstem met Koch se postulate (Fig. 1E). Alhoewel al die verkrygde swam-isolate patogenies was en die groenboontjie (cv. Giza 3) kon infekteer, wat tipiese witskimmelsimptome op alle bogrondse dele (Fig. 1F) kon veroorsaak, veral op die stingels (Fig. 1G) en peule (Fig. 1H) 10 dae na inokulasie (dpi), was isolaat 3 die mees aggressiewe isolaat in twee onafhanklike eksperimente. Isolaat 3 het die hoogste siekte-ernst (%) op boontjieplante gehad (onderskeidelik 24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0 en 76.7 ± 3.1 7, 14 en 21 dae na infeksie; Figuur 1F).
Die identifikasie van die mees indringende S. sclerotiorum-isolaat #3 is verder bevestig op grond van interne getranskribeerde spasieerder (ITS) volgordebepaling (Fig. 1I). Filogenetiese analise tussen isolaat #3 en 20 verwysingsisolate/stamme het hoë ooreenkoms (>99%) tussen hulle getoon. Dit is opmerklik dat die S. sclerotiorum-isolaat #3 (533 bp) 'n hoë ooreenkoms het met die Amerikaanse S. sclerotiorum-isolaat LPM36 wat uit droë ertjiesade geïsoleer is (GenBank-toegangsnommer MK896659.1; 540 bp) en die Chinese S. sclerotiorum-isolaat YKY211 (GenBank-toegangsnommer OR206374.1; 548 bp), wat violet (Matthiola incana) stamvrot veroorsaak, wat almal afsonderlik bo-aan die dendrogram gegroepeer word (Figuur 1I). Die nuwe volgorde is in die NCBI-databasis gedeponeer en benoem as "Sclerotinia sclerotiorum – isolaat YN-25" (GenBank-toegangsnommer PV202792). Daar kan gesien word dat isolaat 3 die mees indringende isolaat is; daarom is hierdie isolaat gekies vir studie in alle daaropvolgende eksperimente.
Die antibakteriese aktiwiteit van die diamien L-ornitien (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Duitsland) teen verskillende konsentrasies (12.5, 25, 50, 75, 100 en 125 mg/L) teen S. sclerotiorum-isolaat 3 is in vitro ondersoek. Dit is noemenswaardig dat L-ornitien 'n antibakteriese effek uitgeoefen het en die radiale groei van S. sclerotiorum-hifes geleidelik op 'n dosisafhanklike wyse geïnhibeer het (Figuur 2A, B). Teen die hoogste konsentrasie wat getoets is (125 mg/L) het L-ornitien die hoogste miseliale groei-inhibisiekoers (99.62 ± 0.27%; Figuur 2B) getoon, wat gelykstaande was aan die kommersiële swamdoder Rizolex-T (inhibisiekoers 99.45 ± 0.39%; Figuur 2C) teen die hoogste konsentrasie wat getoets is (10 mg/L), wat soortgelyke doeltreffendheid aandui.
Figuur 2. In vitro antibakteriese aktiwiteit van L-ornitien teen Sclerotinia sclerotiorum. (A) Vergelyking van die antibakteriese aktiwiteit van verskillende konsentrasies L-ornitien teen S. sclerotiorum met die kommersiële swamdoder Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Inhibisietempo (%) van S. sclerotiorum miseliale groei na behandeling met verskillende konsentrasies L-ornitien (12.5, 25, 50, 75, 100 en 125 mg/L) of Rizolex-T (2, 4, 6, 8 en 10 mg/L), onderskeidelik. Waardes verteenwoordig die gemiddelde ± SD van vyf biologiese replikate (n = 5). Verskillende letters dui statistiese verskille tussen behandelings aan (p < 0.05). (D, E) Probit-model regressie-analise van L-ornitien en kommersiële swamdoder Rizolex-T, onderskeidelik. Die probit-model se regressielyn word as 'n soliede blou lyn getoon, en die vertrouensinterval (95%) word as 'n stippelrooi lyn getoon.
Daarbenewens is probit-regressie-analise uitgevoer en die ooreenstemmende grafieke word in Tabel 1 en Figure 2D,E getoon. Kortliks, die aanvaarbare hellingwaarde (y = 2.92x − 4.67) en geassosieerde beduidende statistieke (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 en p < 0.0001; Figuur 2D) van L-ornitien het 'n verbeterde antifungale aktiwiteit teen S. sclerotiorum aangedui in vergelyking met die kommersiële swamdoder Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 en p < 0.0001) (Tabel 1).
Tabel 1. Waardes van halfmaksimum inhiberende konsentrasie (IC50) en IC99 (mg/l) van L-ornitien en kommersiële swamdoder “Rizolex-T” teen S. sclerotiorum.
Oor die algemeen het L-ornitien (250 mg/L) die ontwikkeling en erns van witskimmel op behandelde gewone boontjieplante beduidend verminder in vergelyking met onbehandelde S. sclerotiorum-besmette plante (kontrole; Figuur 3A). Kortliks, hoewel die siekte-ernst van onbehandelde besmette kontroleplante geleidelik toegeneem het (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, en 92.33 ± 3.06%), het L-ornitien die siekte-ernst (%) dwarsdeur die eksperiment beduidend verminder (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, en 26.36 ± 3.07) onderskeidelik 7, 14, en 21 dae na behandeling (dpt) (Figuur 3A). Net so, toe S. sclerotiorum-besmette boontjieplante met 250 mg/L L-ornitien behandel is, het die area onder die siekteprogressiekurwe (AUDPC) afgeneem van 1274.33 ± 33.13 in die onbehandelde kontrole tot 281.03 ± 7.95, wat effens laer was as dié van die positiewe kontrole 50 mg/L Rizolex-T-swamdoder (183.61 ± 7.71; Fig. 3B). Dieselfde tendens is in die tweede eksperiment waargeneem.
Fig. 3. Effek van eksogene toediening van L-ornitien op die ontwikkeling van witvrot van gewone boontjies veroorsaak deur Sclerotinia sclerotiorum onder kweekhuistoestande. (A) Siekteprogressiekurwe van witskimmel van gewone boontjies na behandeling met 250 mg/L L-ornitien. (B) Area onder die siekteprogressiekurwe (AUDPC) van witskimmel van gewone boontjies na behandeling met L-ornitien. Waardes verteenwoordig die gemiddelde ± SD van vyf biologiese replikate (n = 5). Verskillende letters dui statisties beduidende verskille tussen behandelings aan (p < 0.05).
Eksogene toediening van 250 mg/L L-ornitien het planthoogte (Fig. 4A), aantal takke per plant (Fig. 4B) en aantal blare per plant (Fig. 4C) geleidelik verhoog na 42 dae. Terwyl die kommersiële swamdoder Rizolex-T (50 mg/L) die grootste effek op alle voedingsparameters wat bestudeer is, gehad het, het eksogene toediening van 250 mg/L L-ornitien die tweede grootste effek gehad in vergelyking met onbehandelde kontroles (Fig. 4A–C). Aan die ander kant het L-ornitienbehandeling geen beduidende effek op die inhoud van fotosintetiese pigmente chlorofil a (Fig. 4D) en chlorofil b (Fig. 4E) gehad nie, maar het die totale karotenoïedinhoud (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) effens verhoog in vergelyking met die negatiewe kontrole (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) en positiewe kontrole (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; Fig. 4F). Oor die algemeen dui hierdie resultate daarop dat L-ornitien nie fitotoksies is vir behandelde peulgewasse nie en selfs hul groei kan stimuleer.
Fig. 4. Effek van eksogene L-ornitien toediening op groei-eienskappe en fotosintetiese pigmente van boontjieblare besmet met Sclerotinia sclerotiorum onder kweekhuistoestande. (A) Planthoogte (cm), (B) Aantal takke per plant, (C) Aantal blare per plant, (D) Chlorofil a inhoud (mg g-1 vr gewig), (E) Chlorofil b inhoud (mg g-1 vr gewig), (F) Totale karotenoïed inhoud (mg g-1 vr gewig). Waardes is die gemiddelde ± SD van vyf biologiese replikate (n = 5). Verskillende letters dui statisties beduidende verskille tussen behandelings aan (p < 0.05).
In situ histochemiese lokalisering van reaktiewe suurstofspesies (ROS; uitgedruk as waterstofperoksied [H2O2]) en vrye radikale (uitgedruk as superoksied-anione [O2•−]) het getoon dat eksogene toediening van L-ornitien (250 mg/L) die ophoping van H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) en O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) aansienlik verminder het in vergelyking met die ophoping van beide onbehandelde besmette plante (onderskeidelik 173.31 ± 12.06 en 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) en plante wat behandel is met 50 mg/L van die kommersiële swamdoder Rizolex-T (onderskeidelik 170.12 ± 9.50 en 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt) na 72 uur. Hoë vlakke van H2O2 en O2•− het onder hpt opgehoop (Fig. 5A, B). Net so het 'n TCA-gebaseerde malondialdehied (MDA)-toets getoon dat S. sclerotiorum-besmette boontjieplante hoër vlakke van MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) in hul blare opgehoop het (Fig. 5C). Eksogene toediening van L-ornitien het egter lipiedperoksidasie aansienlik verminder, soos blyk uit die afname in MDA-inhoud in behandelde plante (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Effek van eksogene L-ornitien toediening op belangrike merkers van oksidatiewe stres en nie-ensiematiese antioksidant verdedigingsmeganismes in boontjieblare besmet met S. sclerotiorum 72 uur na infeksie onder kweekhuistoestande. (A) Waterstofperoksied (H2O2; nmol g−1 FW) teen 72 hpt, (B) superoksied anioon (O2•−; nmol g−1 FW) teen 72 hpt, (C) malondialdehied (MDA; nmol g−1 FW) teen 72 hpt, (D) totale oplosbare fenole (mg GAE g−1 FW) teen 72 hpt, (E) totale oplosbare flavonoïede (mg RE g−1 FW) teen 72 hpt, (F) totale vrye aminosure (mg g−1 FW) teen 72 hpt, en (G) prolieninhoud (mg g−1 FW) teen 72 hpt. Waardes verteenwoordig die gemiddelde ± standaardafwyking (gemiddelde ± SD) van 5 biologiese replikate (n = 5). Verskillende letters dui statisties beduidende verskille tussen behandelings aan (p < 0.05).