Verskillende plantverdedigingsteorieë bied belangrike teoretiese leiding om die patrone van plantgespesialiseerde metabolisme te verduidelik, maar hul belangrikste voorspellings moet nog getoets word. Hier het ons onbevooroordeelde tandem-massaspektrometrie (MS/MS) analise gebruik om die metaboloom van tabakverswakte stamme van individuele plante tot populasies en nou verwante spesies sistematies te ondersoek, en 'n groot aantal massaspektrometriese kenmerkteorieë verwerk gebaseer op saamgestelde spektra in die inligtingsraamwerk om die belangrikste voorspellings van optimale verdediging (OD) en bewegende teiken (MT) teorieë te toets. Die inligtingskomponent van plantmetabolomika is in ooreenstemming met die OD-teorie, maar weerspreek die hoofvoorspelling van die MT-teorie oor metabolomika-dinamika wat deur herbivore veroorsaak word. Van die mikro- tot die makro-evolusionêre skaal is die jasmonaatsein geïdentifiseer as die hoofbepaler van OD, terwyl die etileensein fyn afstemming van die herbivoor-spesifieke reaksie, geannoteer deur die MS/MS molekulêre netwerk, verskaf het.
Spesiale metaboliete met diverse strukture is die hoofdeelnemers in plantaanpassing by die omgewing, veral in die verdediging van vyande (1). Die verstommende diversifikasie van die spesiale metabolisme wat in plante gevind word, het dekades se diepgaande navorsing oor die vele aspekte van ekologiese funksies gestimuleer en 'n lang lys van plantverdedigingsteorieë gevorm, wat die evolusionêre en ekologiese ontwikkeling van plant-insek-interaksies is. Empiriese navorsing bied belangrike leiding (2). Hierdie plantverdedigingsteorieë het egter nie die normatiewe pad van hipotetiese deduktiewe redenasie gevolg nie, waarin sleutelvoorspellings op dieselfde vlak van analise was (3) en eksperimenteel getoets is om die volgende siklus van teoretiese ontwikkeling te bevorder (4). Tegniese beperkings beperk data-insameling tot spesifieke metaboliese kategorieë en sluit omvattende analise van gespesialiseerde metaboliete uit, wat interkategorie-vergelykings wat noodsaaklik is vir teoretiese ontwikkeling, voorkom (5). Die gebrek aan omvattende metabolomika-data en 'n gemeenskaplike geldeenheid om die verwerkingswerkvloei van die metaboliese ruimte tussen verskillende plantgroepe te vergelyk, belemmer die wetenskaplike volwassenheid van die veld.
Die nuutste ontwikkelings op die gebied van tandem massaspektrometrie (MS/MS) metabolomika kan die metaboliese veranderinge binne en tussen spesies van 'n gegewe stelselklade omvattend karakteriseer, en kan gekombineer word met berekeningsmetodes om die strukturele ooreenkoms tussen hierdie komplekse mengsels te bereken. Voorafgaande kennis van chemie (5). Die kombinasie van gevorderde tegnologieë in analise en berekening bied 'n noodsaaklike raamwerk vir langtermyntoetsing van baie voorspellings wat deur die ekologiese en evolusionêre teorieë van metaboliese diversiteit gemaak is. Shannon (6) het inligtingteorie vir die eerste keer in sy baanbrekersartikel in 1948 bekendgestel en die grondslag gelê vir die wiskundige analise van inligting, wat in baie ander velde as die oorspronklike toepassing daarvan gebruik is. In genomika is inligtingteorie suksesvol toegepas om volgordekonserwatiewe inligting te kwantifiseer (7). In transkriptomika-navorsing analiseer inligtingteorie die algehele veranderinge in die transkriptoom (8). In vorige navorsing het ons die statistiese raamwerk van inligtingteorie op metabolomika toegepas om die metaboliese kundigheid van die weefselvlak in plante te beskryf (9). Hier kombineer ons die MS/MS-gebaseerde werkvloei met die statistiese raamwerk van inligtingsteorie, gekenmerk deur die metaboliese diversiteit in die gemeenskaplike geldeenheid, om die belangrikste voorspellings van die plantverdedigingsteorie van die metaboloom wat deur herbivore geïnduseer word, te vergelyk.
Die teoretiese raamwerke van plantverdediging is gewoonlik onderling inklusief en kan in twee kategorieë verdeel word: dié wat probeer om die verspreiding van plantspesifieke metaboliete te verduidelik gebaseer op verdedigingsfunksies, soos optimale verdediging (OD) (10), bewegende teiken (MT) (11) en voorkomsteorie (12), terwyl ander meganiese verklarings soek van hoe veranderinge in hulpbronbeskikbaarheid plantgroei en die ophoping van gespesialiseerde metaboliete, soos koolstof, beïnvloed: voedingstofbalanshipotese (13), groeitempohipotese (14), en die groei- en differensiasie-ewewigshipotese (15). Die twee stelle teorieë is op verskillende vlakke van analise (4). Twee teorieë wat verdedigingsfunksies op die funksionele vlak behels, oorheers egter die gesprek oor plantkonstitutiewe en induseerbare verdediging: OD-teorie, wat aanvaar dat plante slegs in hul duur chemiese verdediging belê wanneer dit nodig is, byvoorbeeld wanneer dit ingeneem word. Wanneer 'n grasdier dus aanval, word die verbinding met 'n verdedigingsfunksie volgens die moontlikheid van toekomstige aanval toegeken (10); Die MT-hipotese stel voor dat daar geen as van gerigte metabolietverandering is nie, maar die metaboliet verander lukraak, wat die moontlikheid skep om die metaboliese "bewegingsteiken" van aanvallende herbivore te belemmer. Met ander woorde, hierdie twee teorieë maak teenoorgestelde voorspellings oor die metaboliese hermodellering wat plaasvind na die aanval van herbivore: die verband tussen die eenrigting-akkumulasie van metaboliete met verdedigingsfunksie (OD) en nie-gerigte metaboliese veranderinge (MT) (11).
Die OD- en MT-hipoteses behels nie net die geïnduseerde veranderinge in die metaboloom nie, maar ook die ekologiese en evolusionêre gevolge van die ophoping van hierdie metaboliete, soos die aanpassingskoste en -voordele van hierdie metaboliese veranderinge in 'n spesifieke ekologiese omgewing (16). Alhoewel beide hipoteses die verdedigingsfunksie van gespesialiseerde metaboliete erken, wat duur mag wees of nie, lê die sleutelvoorspelling wat die OD- en MT-hipoteses onderskei in die rigting van die geïnduseerde metaboliese veranderinge. Die voorspelling van die OD-teorie het tot dusver die meeste eksperimentele aandag gekry. Hierdie toetse sluit die studie van die direkte of indirekte verdedigingsfunksies van verskillende weefsels van spesifieke verbindings in kweekhuise en natuurlike toestande in, sowel as veranderinge in die stadium van plantontwikkeling (17-19). Tot dusver, as gevolg van die gebrek aan 'n werkvloei en statistiese raamwerk vir globale omvattende analise van metaboliese diversiteit van enige organisme, moet die hoofverskilvoorspelling tussen die twee teorieë (dit wil sê die rigting van metaboliese veranderinge) egter nog getoets word. Hier verskaf ons so 'n analise.
Een van die belangrikste eienskappe van plantspesifieke metaboliete is hul uiterste strukturele diversiteit op alle vlakke, van enkele plante en populasies tot soortgelyke spesies (20). Baie kwantitatiewe veranderinge in gespesialiseerde metaboliete kan op die populasieskaal waargeneem word, terwyl sterk kwalitatiewe verskille gewoonlik op spesievlak gehandhaaf word (20). Daarom is plantmetaboliese diversiteit die hoofaspek van funksionele diversiteit, wat die aanpasbaarheid by verskillende nisse weerspieël, veral daardie nisse met verskillende invalmoontlikhede deur spesiale insekte en algemene herbivore (21). Sedert Fraenkel se (22) baanbrekende artikel oor die redes vir die bestaan ​​van plantspesifieke metaboliete, word interaksies met verskeie insekte as belangrike seleksiedruk beskou, en daar word geglo dat hierdie interaksies plante tydens evolusie gevorm het. Metaboliese pad (23). Interspesieverskille in die diversiteit van gespesialiseerde metaboliete kan ook die fisiologiese balans weerspieël wat verband hou met konstitutiewe en induseerbare plantverdediging teen herbivore strategieë, aangesien die twee spesies dikwels negatief met mekaar gekorreleer is (24). Alhoewel dit voordelig kan wees om te alle tye 'n goeie verdediging te handhaaf, bied tydige metaboliese veranderinge wat met verdediging geassosieer word, duidelike voordele deur plante in staat te stel om waardevolle hulpbronne aan ander fisiologiese beleggings toe te ken (19, 24), en die behoefte aan simbiose te vermy. Kollaterale skade (25). Boonop kan hierdie reorganisasies van gespesialiseerde metaboliete wat deur insekherbivore veroorsaak word, lei tot vernietigende verspreiding in die populasie (26), en kan dit direkte lesings van aansienlike natuurlike veranderinge in die jasmoniese suur (JA) sein weerspieël, wat in die populasie gehandhaaf kan word. Hoë en lae JA seine is afwegings tussen verdediging teen herbivore en kompetisie met spesifieke spesies (27). Boonop sal gespesialiseerde metabolietbiosintetiese bane vinnige verlies en transformasie tydens evolusie ondergaan, wat lei tot ongelyke metaboliese verspreiding tussen nou verwante spesies (28). Hierdie polimorfismes kan vinnig gevestig word in reaksie op veranderende herbivoorpatrone (29), wat beteken dat die fluktuasie van herbivoorgemeenskappe 'n sleutelfaktor is wat metaboliese heterogeniteit dryf.
Hier het ons spesifiek die volgende probleme opgelos. (I) Hoe herkonfigureer die herbivore insek die plantmetaboloom? (Ii) Wat is die belangrikste inligtingskomponente van metaboliese plastisiteit wat gekwantifiseer kan word om die voorspellings van die langtermyn-verdedigingsteorie te toets? (Iii) Of die plantmetaboloom op 'n manier wat uniek is aan die aanvaller herprogrammeer moet word, indien wel, watter rol speel planthormone in die aanpassing van 'n spesifieke metaboliese reaksie, en watter metaboliete dra by tot die spesiespesifisiteit van verdediging? (Iv) Aangesien die voorspellings wat deur baie verdedigingsteorieë gemaak word, oor alle vlakke van biologiese weefsels uitgebrei kan word, het ons gevra hoe konsekwent die metaboliese reaksie wat veroorsaak word, is van interne vergelyking tot interspesie-vergelyking? Vir hierdie doel het ons sistematies die blaarmetaboloom van tabaknikotien bestudeer, wat 'n ekologiese modelplant met 'n ryk gespesialiseerde metabolisme is, en effektief is teen die larwes van twee inheemse herbivore, Lepidoptera Datura (Ms) (Baie aggressief, hoofsaaklik gevreet). Op Solanaceae en Spodoptera littoralis (Sl) is katoenblaarwurms 'n soort "genus", met die gasheerplante van Solanaceae en ander gashere van ander genera en families plantvoedsel. Ons het die MS/MS metabolomika-spektrum ontleed en inligtingsteorie statistiese beskrywers onttrek om OD- en MT-teorieë te vergelyk. Spesifisiteitskaarte geskep om die identiteit van sleutelmetaboliete te openbaar. Die analise is uitgebrei na die inheemse populasie van N. nasi en nou verwante tabakspesies om die kovariansie tussen planthormoonseintransduksie en OD-induksie verder te analiseer.
Om 'n algehele kaart oor die plastisiteit en struktuur van die blaarmetaboloom van herbivoor tabak vas te lê, het ons 'n voorheen ontwikkelde analise- en berekeningswerkvloei gebruik om hoë-resolusie data-onafhanklike MS/MS-spektra van plantekstrakte omvattend te versamel en te dekonvoluteer (9). Hierdie ongedifferensieerde metode (genoem MS/MS) kan nie-oorbodige verbindingspektra konstrueer, wat dan gebruik kan word vir alle verbindingvlak-ontledings wat hier beskryf word. Hierdie gedekonvoluteer plantmetaboliete is van verskillende tipes, bestaande uit honderde tot duisende metaboliete (ongeveer 500-1000-s/MS/MS hier). Hier beskou ons metaboliese plastisiteit binne die raamwerk van inligtingsteorie, en kwantifiseer die diversiteit en professionaliteit van die metaboloom gebaseer op die Shannon-entropie van die metaboliese frekwensieverspreiding. Deur die voorheen geïmplementeerde formule (8) te gebruik, het ons 'n stel aanwysers bereken wat gebruik kan word om metaboloomdiversiteit (Hj-aanwyser), metaboliese profielspesialisasie (δj-aanwyser) en metaboliese spesifisiteit van 'n enkele metaboliet (Si-aanwyser) te kwantifiseer. Daarbenewens het ons die Relatiewe Afstandsplastisiteitsindeks (RDPI) toegepas om die metaboloom-induseerbaarheid van herbivore te kwantifiseer (Figuur 1A) (30). Binne hierdie statistiese raamwerk behandel ons die MS/MS-spektrum as die basiese inligtingseenheid, en verwerk die relatiewe oorvloed van MS/MS in 'n frekwensieverspreidingskaart, en gebruik dan Shannon-entropie om metaboloomdiversiteit daaruit te skat. Die metaboloomspesialisasie word gemeet deur die gemiddelde spesifisiteit van 'n enkele MS/MS-spektrum. Daarom word die toename in die oorvloed van sommige MS/MS-klasse na herbivoorinduksie omskep in spektrale induseerbaarheid, RDPI en spesialisasie, dit wil sê die toename in die δj-indeks, omdat meer gespesialiseerde metaboliete geproduseer word en 'n hoë Si-indeks geproduseer word. Die verlaging van die Hj-diversiteitsindeks weerspieël dat óf die aantal gegenereerde MS/MS verminder word, óf die profielfrekwensieverspreiding in 'n minder eenvormige rigting verander, terwyl die algehele onsekerheid daarvan verminder word. Deur die Si-indeksberekening is dit moontlik om uit te lig watter MS/MS deur sekere herbivore geïnduseer word, inteendeel, watter MS/MS nie op die induksie reageer nie, wat 'n sleutelaanwyser is om MT- en OD-voorspelling te onderskei.
(A) Statistiese beskrywers wat gebruik word vir herbivoor (H1 tot Hx) MS/MS data-induseerbaarheid (RDPI), diversiteit (Hj-indeks), spesialisasie (δj-indeks) en metabolietspesifisiteit (Si-indeks). 'n Toename in die graad van spesialisasie (δj) dui daarop dat gemiddeld meer herbivoor spesifieke metaboliete geproduseer sal word, terwyl 'n afname in diversiteit (Hj) 'n afname in die produksie van metaboliete of ongelyke verspreiding van metaboliete in die verspreidingskaart aandui. Die Si-waarde bepaal of die metaboliet spesifiek is vir 'n gegewe toestand (hier, herbivoor) of omgekeerd op dieselfde vlak gehandhaaf word. (B) Konseptuele diagram van verdedigingsteorievoorspelling met behulp van die inligtingsteorie-as. OD-teorie voorspel dat herbivoor-aanval verdedigingsmetaboliete sal verhoog, en sodoende δj sal verhoog. Terselfdertyd neem Hj af omdat die profiel herorganiseer word na die verminderde onsekerheid van metaboliese inligting. Die MT-teorie voorspel dat die aanval van herbivore nie-rigtinggewende veranderinge in die metaboloom sal veroorsaak, waardeur Hj as 'n aanduiding van verhoogde metaboliese inligtingsonsekerheid verhoog word en 'n ewekansige verspreiding van Si veroorsaak word. Ons het ook 'n gemengde model, die beste MT, voorgestel waarin sommige metaboliete met hoër verdedigingswaardes besonder verhoog sal wees (hoë Si-waarde), terwyl ander ewekansige reaksies toon (laer Si-waarde).
Deur gebruik te maak van inligtingsteorie-beskrywers, interpreteer ons die OD-teorie om te voorspel dat herbivoor-geïnduseerde spesiale metabolietveranderinge in 'n ongeïnduseerde konstitutiewe toestand sal lei tot (i) 'n toename in metaboliese spesifisiteit (Si-indeks) wat metabonomiese spesifisiteit (δj-indeks) dryf. Die toename van sekere spesiale metabolietgroepe met 'n hoër verdedigingswaarde, en (ii) die afname in metaboloomdiversiteit (Hj-indeks) as gevolg van die verandering van metaboliese frekwensieverspreiding na meer leptienliggaamsverspreiding. Op die vlak van 'n enkele metaboliet word 'n geordende Si-verspreiding verwag, waar die metaboliet die Si-waarde volgens sy verdedigingswaarde sal verhoog (Figuur 1B). Langs hierdie lyn verduidelik ons ​​die MT-teorie om te voorspel dat opwekking sal lei tot (i) nie-rigtingveranderinge in metaboliete wat lei tot 'n afname in die δj-indeks, en (ii) 'n toename in die Hj-indeks as gevolg van 'n toename in metaboliese onsekerheid. Of ewekansigheid, wat gekwantifiseer kan word deur Shannon-entropie in die vorm van veralgemeende diversiteit. Wat die metaboliese samestelling betref, sal die MT-teorie die ewekansige verspreiding van Si voorspel. Met inagneming dat sekere metaboliete onder spesifieke toestande onder spesifieke toestande verkeer, en ander toestande nie onder spesifieke toestande is nie, en hul verdedigingswaarde van die omgewing afhang, het ons ook 'n gemengde verdedigingsmodel voorgestel, waarin δj en Hj in twee langs Si versprei is. Toename in alle rigtings, slegs sekere metabolietgroepe, wat hoër verdedigingswaardes het, sal Si veral verhoog, terwyl ander 'n ewekansige verspreiding sal hê (Figuur 1B).
Om die herdefinieerde verdedigingsteorievoorspelling op die as van die inligtingsteorie-beskrywer te toets, het ons kundige (Ms) of generalis (Sl) herbivoorlarwes op die blare van Nepenthes pallens opgewek (Figuur 2A). Deur MS/MS-analise te gebruik, het ons 599 nie-oorbodige MS/MS-spektra (datalêer S1) verkry uit metanolekstrakte van blaarweefsel wat na ruspevoeding versamel is. Deur RDPI-, Hj- en δj-indekse te gebruik om die herkonfigurasie van inligtinginhoud in MS/MS-konfigurasielêers te visualiseer, word interessante patrone getoon (Figuur 2B). Die algehele tendens is dat, soos beskryf deur die inligtingbeskrywer, soos die ruspes aanhou om blare te eet, die graad van alle metaboliese herorganisasie oor tyd toeneem: 72 uur nadat die herbivoor geëet het, neem die RDPI aansienlik toe. In vergelyking met die onbeskadigde kontrole, was Hj aansienlik verminder, wat te wyte was aan die verhoogde graad van spesialisasie van die metaboliese profiel, wat gekwantifiseer is deur die δj-indeks. Hierdie oënskynlike tendens stem ooreen met die voorspellings van die OD-teorie, maar is teenstrydig met die hoofvoorspellings van die MT-teorie, wat glo dat ewekansige (nie-rigtinggewende) veranderinge in metabolietvlakke as 'n verdedigende kamoeflering gebruik word (Figuur 1B). Alhoewel die orale afskeiding (OS) elisitorinhoud en voedingsgedrag van hierdie twee herbivore verskil, het hul direkte voeding gelei tot soortgelyke veranderinge in die rigtings van Hj en δj gedurende die 24-uur en 72-uur oesperiodes. Die enigste verskil het voorgekom na 72 uur van RDPI. In vergelyking met dié wat deur Ms-voeding veroorsaak is, was die algehele metabolisme wat deur Sl-voeding geïnduseer is, hoër.
(A) Eksperimentele ontwerp: gewone vark (S1) of kundige (Ms) herbivore word gevoer met ontsoute blare van bekerplante, terwyl vir gesimuleerde herbivorie die OS van Ms (W + OSMs) gebruik word om die punksie van gestandaardiseerde blaarposisieswonde te hanteer. S1 (W + OSSl) larwes of water (W + W). Die kontrole (C) is 'n onbeskadigde blaar. (B) Induseerbaarheids- (RDPI in vergelyking met die kontrolekaart), diversiteits- (Hj-indeks) en spesialisasie- (δj-indeks) indeks bereken vir die spesiale metabolietkaart (599 MS/MS; datalêer S1). Sterretjies dui beduidende verskille aan tussen die direkte herbivoorvoeding en die kontrolegroep (Student se t-toets met gepaarde t-toets, *P<0.05 en ***P<0.001). ns, nie belangrik nie. (C) Tydresolusie-indeks van hoof (blou boks, aminosuur, organiese suur en suiker; datalêer S2) en spesiale metabolietspektrum (rooi boks 443 MS/MS; datalêer S1) na gesimuleerde herbivoriebehandeling. Die kleurband verwys na die 95%-vertrouensinterval. Die asterisk dui die beduidende verskil tussen die behandeling en die kontrole aan [kwadratiese variansie-analise (ANOVA), gevolg deur Tukey se eerlik beduidende verskil (HSD) vir post hoc veelvuldige vergelykings, *P<0.05, **P<0.01 en *** P <0.001]. (D) Spesialisering van spreidingsgrafieke en spesiale metabolietprofiele (herhaalde monsters met verskillende behandelings).
Om te ondersoek of die herbivoor-geïnduseerde hermodellering op die metaboloomvlak weerspieël word in die veranderinge in die vlak van individuele metaboliete, het ons eers gefokus op die metaboliete wat voorheen bestudeer is in die blare van Nepenthes pallens met bewese herbivoorweerstand. Fenoliese amiede is hidroksisinnamamied-poliamienkonjugate wat ophoop tydens die herbivorieproses van insekte en bekend is om insekprestasie te verminder (32). Ons het die voorlopers van die ooreenstemmende MS/MS deursoek en hul kumulatiewe kinetiese kurwes geteken (Figuur S1). Dit is geen verrassing dat fenolderivate wat nie direk betrokke is by die verdediging teen herbivore nie, soos chlorogene suur (CGA) en rutin, afgereguleer word na herbivorie. In teenstelling hiermee kan herbivore fenolamiede hoogs potent maak. Die voortdurende voeding van die twee herbivore het gelei tot byna dieselfde opwekkingsspektrum van fenolamiede, en hierdie patroon was veral duidelik vir de novo sintese van fenolamiede. Dieselfde verskynsel sal waargeneem word wanneer die 17-hidroksigeraniel nonaandiol diterpeenglikosiede (17-HGL-DTGs)-roete ondersoek word, wat 'n groot aantal asikliese diterpene met effektiewe anti-herbivoorfunksies produseer (33), waarvan Ms Voeding met Sl 'n soortgelyke ekspressieprofiel veroorsaak het (Figuur S1)).
Die moontlike nadeel van direkte herbivoorvoedingseksperimente is die verskil in blaarverbruikstempo en voedingstyd van herbivore, wat dit moeilik maak om die herbivoorspesifieke effekte wat deur wonde en herbivore veroorsaak word, uit te skakel. Om die herbivoorspesiespesifisiteit van die geïnduseerde blaarmetaboliese reaksie beter op te los, het ons die voeding van Ms- en Sl-larwes gesimuleer deur die vars versamelde OS (OSM en OSS1) onmiddellik op die standaardpunksie W van konsekwente blaarposisies toe te pas. Hierdie prosedure word W + OS-behandeling genoem, en dit standaardiseer die induksie deur die aanvang van die reaksie wat deur die herbivoor veroorsaak word, presies te tydsbereken sonder om verwarrende effekte van verskille in die tempo of hoeveelheid weefselverlies te veroorsaak (Figuur 2A) (34). Deur die MS/MS-analise- en berekeningspyplyn te gebruik, het ons 443 MS/MS-spektra (datalêer S1) verkry, wat oorvleuel het met die spektra wat voorheen uit direkte voedingseksperimente saamgestel is. Die inligtingsteorie-analise van hierdie MS/MS-datastel het getoon dat die herprogrammering van blaargespesialiseerde metabolome deur die simulasie van herbivore OS-spesifieke induksies getoon het (Figuur 2C). In die besonder, in vergelyking met OSS1-behandeling, het OSM 'n verbetering van metaboloomspesialisasie na 4 uur veroorsaak. Dit is opmerklik dat in vergelyking met die direkte herbivoorvoedingseksperimentele datastel, die metaboliese kinetika wat in tweedimensionele ruimte gevisualiseer is met behulp van Hj en δj as koördinate en die rigting van die metaboloomspesialisasie in reaksie op gesimuleerde herbivoorbehandeling oor tyd konsekwent toeneem (Figuur 2D). Terselfdertyd het ons die inhoud van aminosure, organiese sure en suikers gekwantifiseer (datalêer S2) om te ondersoek of hierdie geteikende toename in metaboloomkundigheid te wyte is aan die herkonfigurasie van sentrale koolstofmetabolisme in reaksie op gesimuleerde herbivore (Figuur S2). Om hierdie patroon beter te verduidelik, het ons die metaboliese akkumulasiekinetika van die voorheen bespreekte fenolamied- en 17-HGL-DTG-paaie verder gemonitor. Die OS-spesifieke induksie van herbivore word omskep in 'n differensiële herrangskikkingspatroon binne fenolamiedmetabolisme (Figuur S3). Fenoliese amiede wat kumarien- en kafeïelmolekules bevat, word verkieslik deur OSS1 geïnduseer, terwyl OSM'e 'n spesifieke induksie van ferulielkonjugate veroorsaak. Vir die 17-HGL-DTG-roete is differensiële OS-induksie deur stroomaf malonilering en dimalonileringprodukte waargeneem (Figuur S3).
Vervolgens het ons die OS-geïnduseerde transkriptoomplastisiteit bestudeer met behulp van die tydverloop-mikroarray-datastel, wat die gebruik van OSM's simuleer om die blare van die rosetplantblare in herbivore te behandel. Die monsternemingskinetika oorvleuel basies met die kinetika wat in hierdie metabolomika-studie gebruik is (35). In vergelyking met die metaboloomherkonfigurasie waarin metaboliese plastisiteit veral oor tyd verhoog word, neem ons tydelike transkripsie-uitbarstings waar in blare wat deur Ms geïnduseer word, waar transkriptoom-induseerbaarheid (RDPI) en spesialisasie (δj) op 1 is. Daar was 'n beduidende toename in ure, en diversiteit (Hj) op hierdie tydstip, die uitdrukking van BMP1 was beduidend verminder, gevolg deur die verslapping van transkriptoomspesialisasie (Figuur S4). Metaboliese geenfamilies (soos P450, glikosieltransferase en BAHD-asieltransferase) neem deel aan die proses van die samestelling van spesiale metaboliete uit strukturele eenhede afgelei van primêre metabolisme, volgens die voorgenoemde vroeë hoëspesialiseringsmodel. As 'n gevallestudie is die fenielalanienroete geanaliseer. Die analise het bevestig dat die kerngene in fenolamiedmetabolisme hoogs OS-geïnduseerd is in herbivore in vergelyking met onversadigde plante, en nou in lyn is in hul uitdrukkingspatrone. Die transkripsiefaktor MYB8 en strukturele gene PAL1, PAL2, C4H en 4CL in die stroomop van hierdie pad het vroeë inisiasie van transkripsie getoon. Asieltransferases wat 'n rol speel in die finale samestelling van fenolamied, soos AT1, DH29 en CV86, vertoon 'n langdurige opreguleringspatroon (Figuur S4). Bogenoemde waarnemings dui daarop dat die vroeë inisiasie van transkriptoomspesialisasie en die latere verbetering van metabolomika-spesialisasie 'n gekoppelde modus is, wat moontlik te wyte is aan die sinchrone regulatoriese stelsel wat 'n kragtige verdedigingsreaksie inisieer.
Die herkonfigurasie in planthormoonseintransduksie dien as 'n regulatoriese laag wat herbivoorinligting integreer om die fisiologie van plante te herprogrammeer. Na die herbivoorsimulasie het ons die kumulatiewe dinamika van sleutel-planthormoonkategorieë gemeet en die temporale ko-ekspressie tussen hulle gevisualiseer [Pearson-korrelasiekoëffisiënt (PCC) > 0.4] (Figuur 3A). Soos verwag, is planthormone wat verband hou met biosintese gekoppel binne die planthormoon-ko-ekspressienetwerk. Daarbenewens word metaboliese spesifisiteit (Si-indeks) na hierdie netwerk gekarteer om die planthormone wat deur verskillende behandelings geïnduseer word, uit te lig. Twee hoofareas van herbivoorspesifieke reaksie word geteken: een is in die JA-kluster, waar JA (sy biologies aktiewe vorm JA-Ile) en ander JA-derivate die hoogste Si-telling toon; die ander is etileen (ET). Gibberellien het slegs 'n matige toename in herbivoorspesifisiteit getoon, terwyl ander planthormone, soos sitokinien, ouksien en absisiensuur, lae induksiespesifisiteit vir herbivore gehad het. In vergelyking met die gebruik van W + W alleen, kan die versterking van die piekwaarde van JA-derivate deur die OS-toepassing (W + OS) basies omskep word in 'n sterk spesifieke aanduiding van JA's. Onverwags is OSM en OSS1 met verskillende elisitorinhoud bekend daarvoor dat hulle soortgelyke ophoping van JA en JA-Ile veroorsaak. In teenstelling met OSS1, word OSM spesifiek en sterk geïnduseer deur OSM's, terwyl OSS1 nie die reaksie van basale wonde versterk nie (Figuur 3B).
(A) Ko-ekspressie netwerkanalise gebaseer op PCC berekening van herbivoor-geïnduseerde planthormoon akkumulasie kinetika simulasie. Die knoop verteenwoordig 'n enkele planthormoon, en die grootte van die knoop verteenwoordig die Si-indeks spesifiek vir die planthormoon tussen behandelings. (B) Akkumulasie van JA, JA-Ile en ET in blare veroorsaak deur verskillende behandelings aangedui deur verskillende kleure: appelkoos, W + OSM; blou, W + OSSl; swart, W + W; grys, C (kontrole). Sterretjies dui beduidende verskille tussen behandeling en kontrole aan (tweerigting ANOVA gevolg deur Tukey HSD post hoc veelvuldige vergelyking, *** P <0.001). Inligtingteorie-analise van (C)697 MS/MS (datalêer S1) in JA biosintese en verswakte persepsiespektrum (irAOC en irCOI1) en (D)585 MS/MS (datalêer S1) in ETR1 met verswakte ET sein. Twee gesimuleerde herbivoorbehandelings het plantlyne en leë draer (EV) kontroleplante geaktiveer. Sterretjies dui beduidende verskille aan tussen W+OS-behandeling en onbeskadigde kontrole (tweerigting-ANOVA gevolg deur Tukey HSD post hoc meervoudige vergelyking, *P<0.05, **P<0.01 en ***P<0.001). (E) Verspreide grafieke van verspreide teenkanting teen spesialisasie. Die kleure verteenwoordig verskillende geneties gemodifiseerde stamme; die simbole verteenwoordig verskillende behandelingsmetodes: driehoek, W + OSS1; reghoek, W + OSM; sirkel C
Vervolgens gebruik ons ​​'n geneties gemodifiseerde stam van verswakte Nepenthes (irCOI1 en sETR1) in die sleutelstappe van JA- en ET-biosintese (irAOC en irACO) en persepsie (irCOI1 en sETR1) om die metabolisme van hierdie twee planthormone op herbivore te analiseer. Die relatiewe bydrae van herprogrammering. In ooreenstemming met vorige eksperimente, het ons die induksie van herbivoor-OS in leë draer (EV) plante bevestig (Figuur 3, C tot D) en die algehele afname in die Hj-indeks wat deur OSM veroorsaak word, terwyl die δj-indeks toegeneem het. Die reaksie is meer prominent as die reaksie wat deur OSS1 veroorsaak word. 'n Twee-lyn grafiek wat Hj en δj as koördinate gebruik, toon die spesifieke deregulering (Figuur 3E). Die mees voor die hand liggende tendens is dat in stamme wat JA-sein kort, die metaboloomdiversiteit en spesialisasieveranderinge wat deur herbivore veroorsaak word, byna heeltemal uitgeskakel word (Figuur 3C). In teenstelling hiermee verswak die stille ET-persepsie in sETR1-plante, hoewel die algehele effek op veranderinge in herbivore metabolisme baie laer is as dié van JA-seintransduksie, die verskil in Hj- en δj-indekse tussen OSM- en OSS1-eksitasies (Figuur 3D en Figuur S5). Dit dui daarop dat ET-seintransduksie, benewens die kernfunksie van JA-seintransduksie, ook dien as 'n fyn afstemming van die spesiespesifieke metaboliese reaksie van herbivore. In ooreenstemming met hierdie fyn afstemmingsfunksie was daar geen verandering in die algehele metaboloom-induseerbaarheid in sETR1-plante nie. Aan die ander kant, in vergelyking met sETR1-plante, het irACO-plante soortgelyke algehele amplitudes van metaboliese veranderinge wat deur herbivore veroorsaak is, geïnduseer, maar beduidend verskillende Hj- en δj-tellings tussen OSM- en OSS1-uitdagings getoon (Figuur S5).
Om gespesialiseerde metaboliete te identifiseer wat belangrike bydraes tot die spesiespesifieke reaksie van herbivore lewer en hul produksie deur ET-seine te verfyn, het ons die voorheen ontwikkelde strukturele MS/MS-metode gebruik. Hierdie metode maak staat op die bi-groeperingsmetode om die metaboliese familie weer af te lei uit MS/MS-fragmente [genormaliseerde puntproduk (NDP)] en ooreenkomstelling gebaseer op neutrale verlies (NL). Die MS/MS-datastel wat saamgestel is deur die analise van ET-transgeniese lyne, het 585 MS/MS (datalêer S1) geproduseer, wat opgelos is deur hulle in sewe hoof MS/MS-modules (M) te groepeer (Figuur 4A). Sommige van hierdie modules is dig gepak met voorheen gekarakteriseerde spesiale metaboliete: byvoorbeeld, M1, M2, M3, M4 en M7 is ryk aan verskeie fenolderivate (M1), flavonoïedglikosiede (M2), asielsuikers (M3 en M4), en 17-HGL-DTG (M7). Daarbenewens word die metaboliese spesifieke inligting (Si-indeks) van 'n enkele metaboliet in elke module bereken, en die Si-verspreiding daarvan kan intuïtief gesien word. Kortliks, MS/MS-spektra wat hoë herbivorie- en genotipe-spesifisiteit toon, word gekenmerk deur hoë Si-waardes, en kurtose-statistieke dui die verspreiding van pels op die regtersterthoek aan. Een so 'n maer kolloïedverspreiding is in M1 waargeneem, waarin fenolamied die hoogste Si-fraksie getoon het (Figuur 4B). Die voorheen genoemde herbivore induseerbare 17-HGL-DTG in M7 het 'n matige Si-telling getoon, wat 'n matige mate van differensiële regulering tussen die twee OS-tipes aandui. In teenstelling hiermee is die meeste konstitutief geproduseerde gespesialiseerde metaboliete, soos rutin, CGA en asielsuikers, onder die laagste Si-tellings. Om die strukturele kompleksiteit en Si-verspreiding tussen spesiale metaboliete beter te ondersoek, is 'n molekulêre netwerk vir elke module gekonstrueer (Figuur 4B). 'n Belangrike voorspelling van die OD-teorie (opgesom in Figuur 1B) is dat die herorganisasie van spesiale metaboliete na herbivorie tot eenrigtingveranderinge in metaboliete met hoë verdedigingswaarde moet lei, veral deur hul spesifisiteit te verhoog (in teenstelling met ewekansige verspreiding) Modus) Verdedigende metaboliet voorspel deur MT-teorie. Die meeste van die fenolderivate wat in M1 opgehoop word, is funksioneel verwant aan die afname in insekprestasie (32). Toe die Si-waardes in die M1-metaboliete tussen die geïnduseerde blare en die samestellende blare van die EV-kontroleplante na 24 uur vergelyk is, het ons waargeneem dat die metaboliese spesifisiteit van baie metaboliete na herbivore insekte 'n beduidende toenemende neiging het (Figuur 4C). Die spesifieke toename in Si-waarde is slegs in verdedigende fenolamiede waargeneem, maar geen toename in Si-waarde is in ander fenole en onbekende metaboliete wat in hierdie module saambestaan, waargeneem nie. Dit is 'n gespesialiseerde model wat verband hou met die OD-teorie. Die hoofvoorspellings van metaboliese veranderinge wat deur herbivore veroorsaak word, is konsekwent. Om te toets of hierdie besonderheid van die fenolamiedspektrum deur OS-spesifieke ET geïnduseer is, het ons die metaboliet Si-indeks geplot en 'n differensiële uitdrukkingswaarde tussen OSM en OSS1 in die EV- en sETR1-genotipes veroorsaak (Figuur 4D). In sETR1 is die fenamied-geïnduseerde verskil tussen OSM en OSS1 aansienlik verminder. Die bi-groeperingsmetode is ook toegepas op MS/MS-data wat versamel is in stamme met onvoldoende JA om die hoof MS/MS-modules wat verband hou met JA-gereguleerde metaboliese spesialisasie af te lei (Figuur S6).
(A) Die groeperingsresultate van 585 MS/MS gebaseer op gedeelde fragment (NDP-ooreenkoms) en gedeelde neutrale verlies (NL-ooreenkoms) lei daartoe dat die module (M) ooreenstem met die bekende verbindingfamilie, of deur onbekende of swak gemetaboliseerde metabolietsamestelling. Langs elke module word die metaboliet (MS/MS) spesifieke (Si) verspreiding getoon. (B) Modulêre molekulêre netwerk: Knooppunte verteenwoordig MS/MS en rande, NDP (rooi) en NL (blou) MS/MS-tellings (afsnypunt, > 0.6). Die gegradeerde metabolietspesifisiteitsindeks (Si) gekleur gebaseer op die module (links) en gekarteer na die molekulêre netwerk (regs). (C) Module M1 van EV-plant in konstitutiewe (kontrole) en geïnduseerde toestand (gesimuleerde herbivoor) na 24 uur: molekulêre netwerkdiagram (Si-waarde is die nodusgrootte, verdedigende fenolamied word in blou uitgelig). (D) Die M1 molekulêre netwerkdiagram van die spektrumlyn sETR1 met verswakte EV- en ET-persepsie: die fenoliese verbinding wat deur die groen sirkelknoop voorgestel word, en die beduidende verskil (P-waarde) tussen W + OSM- en W + OSS1-behandelings as knoopgrootte. CP, N-kaffeoïel-tirosien; CS, N-kaffeoïel-spermidien; FP, N-feruliensuurester-uriensuur; FS, N-feruliel-spermidien; CoP, N', N“-Coumaroliel-tirosien; DCS, N', N”-dikaffeoïel-spermidien; CFS, N', N”-kaffeoïel, feruloïel-spermidien; Lycium barbarum in wolfbessie Son; Nick. O-AS, O-asielsuiker.
Ons het die analise verder uitgebrei vanaf 'n enkele verswakte Nepenthes-genotipe na natuurlike populasies, waar sterk intraspesifieke veranderinge in herbivore JA-vlakke en spesifieke metabolietvlakke voorheen in natuurlike populasies beskryf is (26). Gebruik hierdie datastel om 43 kiemplasmas te dek. Hierdie kiemplasmas bestaan ​​uit 123 spesies plante van N. pallens. Hierdie plante is geneem uit sade wat in verskillende inheemse habitatte in Utah, Nevada, Arizona en Kalifornië versamel is (Figuur S7), ons het die metaboloomdiversiteit (hier genoem populasievlak) β-diversiteit) en die spesialisasie wat deur OSM veroorsaak word, bereken. In ooreenstemming met vorige studies het ons 'n wye reeks metaboliese veranderinge langs die Hj- en δj-asse waargeneem, wat aandui dat kiemplasmas beduidende verskille in die plastisiteit van hul metaboliese reaksies op herbivore het (Figuur S7). Hierdie organisasie herinner aan vorige waarnemings oor die dinamiese reeks JA-veranderinge wat deur herbivore veroorsaak word, en het 'n baie hoë waarde in 'n enkele populasie gehandhaaf (26, 36). Deur JA en JA-Ile te gebruik om die algehele vlakkorrelasie tussen Hj en δj te toets, het ons gevind dat daar 'n beduidende positiewe korrelasie is tussen JA en die metaboloom β diversiteit en spesialisasie-indeks (Figuur S7). Dit dui daarop dat die herbivoor-geïnduseerde heterogeniteit in JA-induksie wat op populasievlak waargeneem word, moontlik te wyte is aan sleutel metaboliese polimorfismes wat veroorsaak word deur seleksie van insekherbivore.
Vorige studies het getoon dat tabaksoorte baie verskil in tipe en relatiewe afhanklikheid van geïnduseerde en konstitutiewe metaboliese verdediging. Daar word geglo dat hierdie veranderinge in anti-herbivoor seintransduksie en verdedigingsvermoëns gereguleer word deur insekpopulasiedruk, plantlewensiklus en verdedigingsproduksiekoste in die nis waar 'n gegewe spesie groei. Ons het die konsekwentheid van blaarmetaboloomhermodellering bestudeer wat geïnduseer word deur herbivore van ses Nicotiana-spesies inheems aan Noord-Amerika en Suid-Amerika. Hierdie spesies is nou verwant aan Nepenthes Noord-Amerika, naamlik Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. verswakte gras, Nicotiana tabacum, lineêre tabak, tabak (Nicotiana spegazzinii) en tabakblaartabak (Nicotiana obtusifolia) (Figuur 5A) (37). Ses van hierdie spesies, insluitend die goed gekarakteriseerde spesie N. please, is eenjarige plante van die petunia-klade, en obtusifolia N. is meerjarige plante van die susterklade Trigonophyllae (38). Vervolgens is W + W, W + OSM en W + OSS1 induksie op hierdie sewe spesies uitgevoer om die spesievlak metaboliese herrangskikking van insekvoeding te bestudeer.
(A) 'n Bootstrap filogenetiese boom gebaseer op maksimum waarskynlikheid [vir kernglutamiensintese (38)] en die geografiese verspreiding van sewe nou verwante Nicotiana-spesies (verskillende kleure) (37). (B) 'n Spreidingsgrafiek van gespesialiseerde diversiteit vir die metaboliese profiele van sewe Nicotiana-spesies (939 MS/MS; datalêer S1). Op spesievlak is metaboloomdiversiteit negatief gekorreleer met die graad van spesialisasie. Die analise van die spesievlakkorrelasie tussen metaboliese diversiteit en spesialisasie en JA-akkumulasie word in Figuur 2 getoon. S9. Kleur, verskillende tipes; driehoek, W + OSS1; reghoek, W + OSM; (C) Nicotiana JA en JA-Ile-dinamika word gerangskik volgens OS-eksitasie-amplitude (tweerigting-ANOVA en Tukey HSD na veelvuldige vergelyking, * P <0.05, ** P <0.01 en * ** Vir vergelyking van W + OS en W + W, P <0.001). Boksgrafiek van (D) diversiteit en (E) spesialisasie van elke spesie na simulasie van herbivore en metiel JA (MeJA). Die asterisk dui die beduidende verskil aan tussen W + OS en W + W of lanolin plus W (Lan + W) of Lan plus MeJA (Lan + MeJa) en Lan-kontrole (tweerigting-variansie-analise, gevolg deur Tukey se HSD post hoc meervoudige vergelyking, *P<0.05, **P<0.01 en ***P<0.001).
Deur die dubbele trosmetode te gebruik, het ons 9 modules van 939 MS/MS (datalêer S1) geïdentifiseer. Die samestelling van MS/MS wat deur verskillende behandelings herkonfigureer is, wissel baie tussen verskillende modules tussen spesies (Figuur S8). Deur Hj (hier verwys na as spesievlak-γ-diversiteit) en δj te visualiseer, word onthul dat verskillende spesies in baie verskillende groepe in die metaboliese ruimte saamsmelt, waar spesievlak-verdeling gewoonlik meer prominent is as opwekking. Met die uitsondering van N. linear en N. obliquus, vertoon hulle 'n wye dinamiese reeks induksie-effekte (Figuur 5B). In teenstelling hiermee het spesies soos N. purpurea en N. obtusifolia 'n minder ooglopende metaboliese reaksie op behandeling, maar die metaboloom is meer divers. Die spesiespesifieke verspreiding van die geïnduseerde metaboliese reaksie het gelei tot 'n beduidende negatiewe korrelasie tussen spesialisasie en gamma-diversiteit (PCC = -0.46, P = 4.9×10-8). OS-geïnduseerde veranderinge in JA-vlakke is positief gekorreleer met metaboloomspesialisasie, en negatief gekorreleer met die metaboliese gamma-diversiteit wat deur elke spesie vertoon word (Figuur 5B en Figuur S9). Dit is opmerklik dat die spesies wat in Figuur 5C in die omgangstaal as "seinrespons"-spesies na verwys word, soos Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute, en Nepenthes attenuated, beduidende tekens na 30 minute veroorsaak het. Die onlangse OS-spesifieke JA- en JA-Ile-uitbrake, terwyl ander bakterieë wat "sein-onresponsief" genoem word, soos Nepenthes mills, Nepenthes powdery en N. obtusifolia, slegs JA-Ile Edge-induksie toon sonder enige OS-spesifisiteit (Figuur 5C). Op die metaboliese vlak, soos hierbo genoem, vir verswakte Nepenthes, het die sein-responsiewe stowwe OS-spesifisiteit getoon en δj beduidend verhoog, terwyl Hj verminder is. Hierdie OS-spesifieke priming-effek is nie waargeneem in spesies wat as sein-nie-reaktiewe spesies geklassifiseer is nie (Figuur 5, D en E). OS-spesifieke metaboliete word meer gereeld gedeel tussen sein-responsiewe spesies, en hierdie seingroepe groepeer met spesies met swakker seinresponse, terwyl spesies met swakker seinresponse minder interafhanklikheid toon (Figuur S8). Hierdie resultaat dui daarop dat die OS-spesifieke induksie van JA's en die OS-spesifieke herkonfigurasie van die stroomaf metaboloom op spesievlak gekoppel is.
Vervolgens het ons 'n lanolinpasta wat metiel JA (MeJA) bevat, gebruik om plante te behandel om te ondersoek of hierdie koppelmodusse beperk word deur die beskikbaarheid van JA wat deur eksogene JA toegedien word, wat in die sitoplasma van plante sal wees. Vinnige deesterifikasie is JA. Ons het dieselfde tendens gevind van die geleidelike verandering van sein-responsiewe spesies na sein-nie-responsiewe spesies wat veroorsaak word deur die deurlopende toevoer van JA (Figuur 5, D en E). Kortliks, MeJA-behandeling het die metabolome van lineêre nematodes, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens en N. mikimotoi, sterk herprogrammeer, wat gelei het tot 'n beduidende toename in δj en 'n afname in Hj. N. purpurea het slegs 'n toename in δj getoon, maar nie Hj nie. N. obtusifolia, wat voorheen getoon is om uiters lae vlakke van JA's op te bou, reageer ook swak op MeJA-behandeling in terme van metaboloomherkonfigurasie. Hierdie resultate dui daarop dat JA-produksie of seintransduksie fisiologies beperk is in sein-nie-responsiewe spesies. Om hierdie hipotese te toets, het ons die vier spesies (N. pallens, N. mills, N. pink en N. microphylla) bestudeer wat deur W + W, W + OSMs en W + OSS1 Transkriptome geïnduseer is (39). In ooreenstemming met die patroon van metaboloomhermodellering, is die spesies goed geskei in die transkriptomeruimte, waaronder N. attenuated die hoogste OS-geïnduseerde RDPI getoon het, terwyl N. gracilis die laagste gehad het (Figuur 6A). Daar is egter gevind dat die transkriptomediversiteit geïnduseer deur N. oblonga die laagste onder die vier spesies was, in teenstelling met die hoogste metabonomiese diversiteit van N. oblonga wat voorheen in sewe spesies getoon is. Vorige studies het getoon dat 'n stel gene wat verband hou met vroeë verdedigingsseine, insluitend JA-seine, die spesifisiteit van vroeë verdedigingsreaksies wat deur herbivoorverwante elicitors in Nicotiana-spesies geïnduseer word, verklaar (39). Die vergelyking van die JA-seinweë tussen hierdie vier spesies het 'n interessante patroon aan die lig gebring (Figuur 6B). Die meeste gene in hierdie pad, soos AOC, OPR3, ACX en COI1, het relatief hoë vlakke van induksie in hierdie vier spesies getoon. 'n Sleutelgeen, JAR4, omskep egter JA in sy biologies aktiewe vorm van JA-Ile-geakkumuleerde transkripte, en die transkripsievlak daarvan is baie laag, veral in N. mills, Nepenthes pieris en N. microphylla. Daarbenewens is slegs die transkripsie van 'n ander geen AOS nie in N. bifidum opgespoor nie. Hierdie veranderinge in geen-ekspressie kan verantwoordelik wees vir die uiterste fenotipes wat veroorsaak word deur die lae JA-produksie in sein-anergiese spesies en die induksie van N. gracilis.
(A) Inligtingsteorie-analise van die herprogrammering van vroeë transkripsieresponse van vier nou verwante tabakspesies wat 30 minute na herbivorie-induksie gemonster is. RDPI word bereken deur die blare wat deur die herbivoor-OS geïnduseer is, te vergelyk met die wondkontrole. Die kleure dui verskillende spesies aan, en die simbole dui verskillende behandelingsmetodes aan. (B) Analise van geenekspressie in JA-seinweë tussen vier spesies. Die vereenvoudigde JA-pad word langs die blokkie-grafiek getoon. Verskillende kleure dui verskillende verwerkingsmetodes aan. Die asterisk dui aan dat daar 'n beduidende verskil is tussen die W + OS-behandeling en die W + W-kontrole (vir die Student se t-toets vir paargewyse verskille, *P<0.05, **P<0.01 en ***P<0.001). OPDA, 12-oksofitodiëensuur; OPC-8: 0,3-okso-2(2′(Z)-penteniel)-siklopentaan-1-oktaansuur.
In die laaste deel het ons bestudeer hoe insekspesiespesifieke hermodellering van die metaboloom van verskillende plantspesies weerstandbiedend teen herbivore kan wees. Vorige navorsing het die Nicotiana-genus beklemtoon. Hul weerstand teen Ms en larwes verskil baie (40). Hier het ons die verband tussen hierdie model en hul metaboliese plastisiteit bestudeer. Deur die bogenoemde vier tabakspesies te gebruik, en die korrelasie tussen die diversiteit en spesialisasie van die metaboloom wat deur herbivore veroorsaak word en die weerstand van plante teen Ms en Sl te toets, het ons gevind dat die weerstand, diversiteit en spesialisasie teenoor die generalis Sl positief gekorreleer is, terwyl die korrelasie tussen weerstand teen kundige dames en spesialisasie swak is, en die korrelasie met diversiteit nie beduidend is nie (Figuur S10). Wat S1-weerstand betref, het beide die verswakte N. chinensis en N. gracilis, wat voorheen getoon is om beide JA-seintransduksievlakke en metaboloomplastisiteit te vertoon, baie verskillende reaksies op herbivoorinduksie gehad, en hulle het ook soortgelyke hoë weerstand getoon. Geslag.
In die afgelope sestig jaar het die plantverdedigingsteorie 'n teoretiese raamwerk verskaf, gebaseer op wat navorsers 'n aansienlike aantal evolusies en funksies van plantgespesialiseerde metaboliete voorspel het. Die meeste van hierdie teorieë volg nie die normale prosedure van sterk afleidings nie (41). Hulle stel sleutelvoorspellings (3) op dieselfde vlak van analise voor. Wanneer die toetsing van sleutelvoorspellings spesifieke teorieë toelaat om geanaliseer te word, sal dit die Die veld beweeg vorentoe. Word ondersteun, maar verwerp ander (42). In plaas daarvan maak die nuwe teorie voorspellings op verskillende vlakke van analise en voeg 'n nuwe laag beskrywende oorwegings by (42). Die twee teorieë wat op die funksionele vlak voorgestel word, MT en OD, kan egter maklik verduidelik word as belangrike voorspellings van gespesialiseerde metaboliese veranderinge wat deur herbivore veroorsaak word: OD-teorie glo dat veranderinge in gespesialiseerde metaboliese "ruimte" hoogs rigtinggewend is. Die MT-teorie glo dat hierdie veranderinge nie-rigtinggewend en lukraak in die metaboliese ruimte geleë sal wees, en geneig is om metaboliete met 'n hoë verdedigingswaarde te hê. Vorige ondersoeke van OD- en MT-voorspellings is getoets met behulp van 'n nou stel a priori "verdedigings"-verbindings. Hierdie metaboliet-gesentreerde toetse sluit die vermoë uit om die omvang en trajek van metaboloomherkonfigurasie tydens herbivorie te analiseer, en laat nie toe dat toetsing binne 'n konsekwente statistiese raamwerk sleutelvoorspellings vereis wat as 'n geheel beskou kan word nie. Kwantifiseer veranderinge in plantmetabolome. Hier het ons die innoverende tegnologie in metabolomika gebaseer op berekenings-MS gebruik en dekonvolusie-MS-analise in die algemene geldigheid van inligtingteorie-beskrywers uitgevoer om die onderskeid tussen die twee wat op die globale metabolomika-vlak voorgestel word, te toets. Die sleutelvoorspelling van hierdie teorie. Inligtingteorie is in baie velde toegepas, veral in die konteks van biodiversiteit en voedingstofvloei-navorsing (43). Sover ons weet, is dit egter die eerste toepassing wat gebruik word om die metaboliese inligtingsruimte van plante te beskryf en ekologiese probleme op te los wat verband hou met tydelike metaboliese veranderinge in reaksie op omgewingsaanwysings. In die besonder lê die vermoë van hierdie metode in die vermoë om patrone binne en tussen plantspesies te vergelyk om te ondersoek hoe herbivore van verskillende spesies tot interspesie-makro-evolusionêre patrone op verskillende vlakke van evolusie ontwikkel het. Metabolisme.
Hoofkomponentanalise (HKA) skakel 'n meerveranderlike datastel om na 'n dimensionaliteitsreduksieruimte sodat die hooftendens van die data verduidelik kan word, daarom word dit gewoonlik as 'n verkennende tegniek gebruik om die datastel te ontleed, soos dekonvolusie-metaboloom. Dimensionaliteitsreduksie sal egter 'n deel van die inligtingsinhoud in die datastel verloor, en HKA kan nie kwantitatiewe inligting verskaf oor eienskappe wat veral relevant is vir ekologiese teorie nie, soos: hoe herbivore diversiteit in gespesialiseerde velde (byvoorbeeld rykdom, verspreiding en oorvloed) metaboliete herkonfigureer? Watter metaboliete is voorspellers van die geïnduseerde toestand van 'n gegewe herbivoor? Vanuit die perspektief van spesifisiteit, diversiteit en induseerbaarheid word die inligtingsinhoud van die blaarspesifieke metabolietprofiel ontbind, en daar word gevind dat die eet van herbivore spesifieke metabolisme kan aktiveer. Onverwags het ons waargeneem dat, soos beskryf in die geïmplementeerde inligtingsteorie-aanwysers, die gevolglike metaboliese situasie 'n groot oorvleueling het na die aanvalle van die twee herbivore (die naggevoerde generalis Sl) en die Solanaceae-kenner Mev. Alhoewel hul voedingsgedrag en konsentrasie beduidend verskil. Vetsuur-aminosuurkonjugaat (FAC) inisieerder in OS (31). Deur herbivoor OS te gebruik om gestandaardiseerde steekwonde te behandel, het gesimuleerde herbivoorbehandeling ook 'n soortgelyke tendens getoon. Hierdie gestandaardiseerde prosedure vir die simulasie van die reaksie van plante op herbivooraanvalle elimineer die verwarrende faktore wat veroorsaak word deur veranderinge in die eetgedrag van herbivore, wat lei tot verskillende grade van skade op verskillende tye (34). FAC, wat bekend is as die hoofoorsaak van OSM, verminder JAS en ander planthormoonresponse in OSS1, terwyl OSS1 honderde kere verminder (31). OSS1 het egter soortgelyke vlakke van JA-akkumulasie veroorsaak in vergelyking met OSM. Daar is voorheen gedemonstreer dat die JA-reaksie in verswakte Nepenthes baie sensitief is vir OSM, waar FAC sy aktiwiteit kan handhaaf selfs al word dit 1:1000 met water verdun (44). Daarom, in vergelyking met OSM, hoewel die FAC in OSS1 baie laag is, is dit voldoende om voldoende JA-uitbraak te veroorsaak. Vorige studies het getoon dat porienagtige proteïene (45) en oligosakkariede (46) as molekulêre leidrade gebruik kan word om plantverdedigingsreaksies in OSS1 te aktiveer. Dit is egter steeds onduidelik of hierdie elisitore in OSS1 verantwoordelik is vir die ophoping van JA wat in die huidige studie waargeneem is.
Alhoewel daar min studies is wat die differensiële metaboliese vingerafdrukke beskryf wat veroorsaak word deur die toediening van verskillende herbivore of eksogene JA of SA (salisielsuur) (47), het niemand die herbivoorspesiespesifieke versteuring in die plantgrasnetwerk en die effekte daarvan op die spesifieke persoonlike inligting versteur nie. Die algehele impak van metabolisme word sistematies bestudeer. Hierdie analise het verder bevestig dat die interne hormoonnetwerkverbinding met ander planthormone anders as JA's die spesifisiteit van die metaboliese herorganisasie wat deur herbivore veroorsaak word, vorm. In die besonder het ons waargeneem dat ET wat deur OSM veroorsaak word, aansienlik groter was as dié wat deur OSS1 veroorsaak word. Hierdie modus is in ooreenstemming met meer FAC-inhoud in OSM, wat 'n noodsaaklike en voldoende voorwaarde is om 'n ET-uitbarsting te veroorsaak (48). In die konteks van die interaksie tussen plante en herbivore, is die seinfunksie van ET op plantspesifieke metabolietdinamika steeds sporadies en teiken slegs 'n enkele verbindinggroep. Daarbenewens het die meeste studies eksogene toepassings van ET of sy voorlopers of verskeie inhibeerders gebruik om die regulering van ET te bestudeer, waaronder hierdie eksogene chemiese toepassings baie nie-spesifieke newe-effekte sal veroorsaak. Na ons wete verteenwoordig hierdie studie die eerste grootskaalse sistematiese ondersoek na die rol van ET in die gebruik van ET om verswakte transgeniese plante te produseer en waar te neem om plantmetaboloomdinamika te koördineer. Herbivoor-spesifieke ET-induksie kan uiteindelik die metaboloomrespons moduleer. Die belangrikste is die transgeniese manipulasie van ET-biosintese (ACO) en persepsie (ETR1) gene wat die herbivoor-spesifieke de novo-akkumulasie van fenolamiede aan die lig gebring het. Daar is voorheen getoon dat ET JA-geïnduseerde nikotienakkumulasie kan verfyn deur putressien N-metieltransferase te reguleer (49). Vanuit 'n meganiese oogpunt is dit egter nie duidelik hoe ET die induksie van fenamied verfyn nie. Benewens die seintransduksiefunksie van ET, kan die metaboliese vloei ook na S-adenosiel-1-metionien oorgeskakel word om die belegging in poliaminofenolamiede te reguleer. S-adenosiel-1-metionien is ET en 'n algemene tussenproduk van die poliamienbiosintetiese pad. Die meganisme waardeur die ET-sein die vlak van fenolamied reguleer, benodig verdere studie.
Vir 'n lang tyd, as gevolg van die groot aantal spesiale metaboliete van onbekende struktuur, was die intense aandag aan spesifieke metaboliese kategorieë nie in staat om die temporale veranderinge van metaboliese diversiteit na biologiese interaksies streng te bepaal nie. Tans, gebaseer op inligtingsteorie-analise, is die hoofresultaat van MS/MS-spektrumverkryging gebaseer op onbevooroordeelde metaboliete dat herbivore wat herbivore eet of simuleer, steeds die algehele metaboliese diversiteit van die blaarmetaboloom verminder terwyl die spesialisasiegraad verhoog word. Hierdie tydelike toename in metaboloomspesifisiteit wat deur herbivore veroorsaak word, word geassosieer met 'n sinergistiese toename in transkriptoomspesifisiteit. Die kenmerk wat die meeste bydra tot hierdie groter metaboloomspesialisasie (met 'n hoër Si-waarde) is die spesiale metaboliet met die voorheen gekarakteriseerde herbivoorfunksie. Hierdie model is in ooreenstemming met die voorspelling van OD-teorie, maar die voorspelling van MT wat verband hou met die ewekansigheid van metaboloomherprogrammering is nie konsekwent nie. Hierdie data is egter ook in ooreenstemming met die voorspelling van die gemengde model (beste MT; Figuur 1B), omdat ander ongekarakteriseerde metaboliete met onbekende verdedigingsfunksies steeds 'n ewekansige Si-verspreiding kan volg.
'n Noemenswaardige patroon wat verder deur hierdie navorsing vasgevang word, is dat van die mikro-evolusievlak (enkele plant- en tabakpopulasie) tot 'n groter evolusionêre skaal (nou verwante tabakspesies), verskillende vlakke van evolusionêre organisasie in die "beste verdediging" is. Daar is beduidende verskille in die vermoëns van herbivore. Moore et al. (20) en Kessler en Kalske (1) het onafhanklik voorgestel om die drie funksionele vlakke van biodiversiteit wat oorspronklik deur Whittaker (50) onderskei is, om te skakel na die konstitutiewe en geïnduseerde temporale veranderinge van chemiese diversiteit; hierdie outeurs het nie opgesom nie. Die prosedures vir grootskaalse metaboloomdata-insameling beskryf ook nie hoe om metaboliese diversiteit uit hierdie data te bereken nie. In hierdie studie sal klein aanpassings aan Whittaker se funksionele klassifikasie α-metaboliese diversiteit as die diversiteit van MS/MS-spektra in 'n gegewe plant beskou, en β-metaboliese diversiteit as die basiese intraspesifieke metabolisme van 'n groep populasies Ruimte, en γ-metaboliese diversiteit sal 'n uitbreiding wees van die analise van soortgelyke spesies.
Die JA-sein is noodsaaklik vir 'n wye reeks herbivoor metaboliese reaksies. Daar is egter 'n gebrek aan streng kwantitatiewe toetsing van die bydrae van intraspesifieke regulering van JA-biosintese tot metaboloomdiversiteit, en of die JA-sein 'n algemene plek is vir stres-geïnduseerde metaboliese diversifikasie op 'n hoër makro-evolusionêre skaal, is steeds ontwykend. Ons het waargeneem dat die herbivore aard van Nepenthes herbivore metaboloomspesialisasie veroorsaak en die variasie van metaboloomspesialisasie binne die populasie van Nicotiana-spesies en tussen nou verwante Nicotiana-spesies sistematies positief gekorreleer is met JA-sein. Boonop, wanneer die JA-sein benadeel word, sal die metaboliese spesifisiteit wat deur 'n enkele genotipe-herbivoor geïnduseer word, gekanselleer word (Figuur 3, C en E). Aangesien die metaboliese spektrumveranderinge van die natuurlik verswakte Nepenthes-populasies meestal kwantitatief is, kan die veranderinge in die metaboliese β-diversiteit en spesifisiteit in hierdie analise grootliks veroorsaak word deur die sterk opwekking van metabolietryke verbindingkategorieë. Hierdie verbindingklasse oorheers 'n deel van die metaboloomprofiel en lei tot 'n positiewe korrelasie met JA-seine.
Omdat die biochemiese meganismes van die tabakspesies wat nou daaraan verwant is, baie verskil, word die metaboliete spesifiek in die kwalitatiewe aspek geïdentifiseer, dus is dit meer analities. Inligtingsteorie se verwerking van die vasgelegde metaboliese profiel toon dat herbivore induksie die afweging tussen metaboliese gamma-diversiteit en spesialisasie vererger. Die JA-sein speel 'n sentrale rol in hierdie afweging. Die toename in metaboloomspesialisasie is in ooreenstemming met die hoof OD-voorspelling en is positief gekorreleer met JA-sein, terwyl JA-sein negatief gekorreleer is met metaboliese gamma-diversiteit. Hierdie modelle dui daarop dat die OD-kapasiteit van plante hoofsaaklik bepaal word deur die plastisiteit van JA, hetsy op 'n mikro-evolusionêre skaal of op 'n groter evolusionêre skaal. Eksogene JA-toepassingseksperimente wat JA-biosintese-defekte omseil, toon verder dat nou verwante tabakspesies onderskei kan word in sein-responsiewe en sein-nie-responsiewe spesies, net soos hul modus van JA en metaboloomplastisiteit wat deur herbivore geïnduseer word. Sein-nie-responsiewe spesies kan nie reageer nie as gevolg van hul onvermoë om endogene JA te produseer en is dus onderhewig aan fisiologiese beperkings. Dit kan veroorsaak word deur mutasies in sommige sleutelgene in die JA-seinweg (AOS en JAR4 in N. crescens). Hierdie resultaat beklemtoon dat hierdie interspesie makro-evolusionêre patrone hoofsaaklik gedryf kan word deur veranderinge in interne hormoonpersepsie en -responsiwiteit.
Benewens die interaksie tussen plante en herbivore, hou die verkenning van metaboliese diversiteit verband met alle belangrike teoretiese vooruitgang in die navorsing van biologiese aanpassing aan die omgewing en die evolusie van komplekse fenotipiese eienskappe. Met die toename in die hoeveelheid data wat deur moderne MS-instrumente verkry word, kan hipotesetoetsing oor metaboliese diversiteit nou individuele/kategorie metabolietverskille oorskry en globale analise uitvoer om onverwagte patrone te openbaar. In die proses van grootskaalse analise is 'n belangrike metafoor die idee om betekenisvolle kaarte te konsep wat gebruik kan word om data te verken. Daarom is 'n belangrike resultaat van die huidige kombinasie van onbevooroordeelde MS/MS metabolomika en inligtingsteorie dat dit 'n eenvoudige metriek bied wat gebruik kan word om kaarte te konstrueer om die metaboliese diversiteit op verskillende taksonomiese skale te blaai. Dit is die basiese vereiste van hierdie metode. Die studie van mikro/makro-evolusie en gemeenskapsekologie.
Op die makro-evolusionêre vlak is die kern van die plant-insek ko-evolusie teorie van Ehrlich en Raven (51) om te voorspel dat die variasie van interspesie metaboliese diversiteit die oorsaak is van die diversifikasie van plantlyne. In die vyftig jaar sedert die publikasie van hierdie baanbrekende werk is hierdie hipotese egter selde getoets (52). Dit is grootliks te wyte aan die filogenetiese eienskappe van vergelykbare metaboliese eienskappe oor langafstand plantlyne. Die seldsaamheid kan gebruik word om teikenanalisemetodes te anker. Die huidige MS/MS-werkvloei wat deur inligtingsteorie verwerk word, kwantifiseer die MS/MS strukturele ooreenkoms van onbekende metaboliete (sonder voorafgaande metabolietseleksie) en skakel hierdie MS/MS'e om in 'n stel MS/MS, dus in professionele metabolisme word hierdie makro-evolusionêre modelle vergelyk in klassifikasieskaal. Eenvoudige statistiese aanwysers. Die proses is soortgelyk aan filogenetiese analise, wat volgordebelyning kan gebruik om die tempo van diversifikasie of karakterevolusie te kwantifiseer sonder voorafgaande voorspelling.
Op die biochemiese vlak toon die siftingshipotese van Firn en Jones (53) dat metaboliese diversiteit op verskillende vlakke gehandhaaf word om grondstowwe te verskaf om die biologiese aktiwiteite van voorheen onverwante of vervangende metaboliete uit te oefen. Inligtingteoriemetodes bied 'n raamwerk waarin hierdie metabolietspesifieke evolusionêre oorgange wat tydens metabolietspesialisasie plaasvind, gekwantifiseer kan word as deel van die voorgestelde evolusionêre siftingsproses: biologies aktiewe aanpassing van lae spesifisiteit na hoë spesifisiteit Geïnhibeerde metaboliete van 'n gegewe omgewing.
Alles in ag genome, in die vroeë dae van molekulêre biologie, is belangrike plantverdedigingsteorieë ontwikkel, en deduktiewe hipotese-gedrewe metodes word wyd beskou as die enigste middel tot wetenskaplike vooruitgang. Dit is grootliks te wyte aan die tegniese beperkings van die meting van die hele metaboloom. Alhoewel hipotese-gedrewe metodes veral nuttig is in die keuse van ander oorsaaklike meganismes, is hul vermoë om ons begrip van biochemiese netwerke te bevorder meer beperk as die berekeningsmetodes wat tans beskikbaar is in hedendaagse data-intensiewe wetenskap. Daarom is teorieë wat nie voorspel kan word nie, ver buite die bestek van beskikbare data, dus kan die hipotetiese formule/toetssiklus van vooruitgang in die navorsingsveld nie afgeskaf word nie (4). Ons voorsien dat die berekeningswerkvloei van metabolomika wat hier bekendgestel word, belangstelling in die onlangse (hoe) en finale (hoekom) kwessies van metaboliese diversiteit kan herontdek, en kan bydra tot 'n nuwe era van teoreties begeleide datawetenskap. Die era het die belangrike teorieë wat vorige generasies geïnspireer het, heroorweeg.
Direkte herbivoorvoeding word uitgevoer deur 'n tweede instarlarwe of Sl-larwe op 'n enkele ligkleurige bekerplantblaar van 'n enkele roosblomplant groot te maak, met 10 plantreplikate per plant. Die inseklarwes is met klampe vasgeklem, en die oorblywende blaarweefsel is 24 en 72 uur na infeksie versamel en vinnig gevries, en die metaboliete is onttrek.
Simuleer herbivore behandeling op 'n hoogs gesinchroniseerde wyse. Die metode is om stofpatroonwiele te gebruik om drie rye dorings aan elke kant van die middelrib van die drie volledig uitgestrekte blare van die plant tydens die groeistadium van die stofkrans te prik, en onmiddellik 1:5 Verdunde Ms toe te dien. Of gebruik handskoenvingers om S1 OS in die prikwond in te voeg. Oes en verwerk 'n blaar soos hierbo beskryf. Gebruik die voorheen beskryfde metode om primêre metaboliete en planthormone te onttrek (54).
Vir eksogene JA-toepassings word die drie blaarsteelblare van elk van die ses roosblomplante van elke spesie behandel met 20 μl lanolinpasta wat 150 μg MeJA (Lan + MeJA) bevat, en 20 μl lanolin plus wondbehandeling (Lan + W), of gebruik 20 μl suiwer lanolin as 'n kontrole. Die blare is 72 uur na behandeling geoes, in vloeibare stikstof gevries en by -80°C gestoor tot gebruik.
Vier JA- en ET-transgeniese lyne, naamlik irAOC (36), irCOI1 (55), irACO en sETR1 (48), is in ons navorsingsgroep geïdentifiseer. irAOC het 'n sterk afname in JA- en JA-Ile-vlakke getoon, terwyl irCOI1 nie sensitief vir JA's was nie. In vergelyking met EV het JA-Ile-akkumulasie toegeneem. Net so sal irACO die produksie van ET verminder, en in vergelyking met EV sal sETR1, wat onsensitief is vir ET, die produksie van ET verhoog.
'n Fotoakoestiese laserspektrometer (Sensor Sense ETD-300 intydse ET-sensor) word gebruik om ET-meting nie-indringend uit te voer. Onmiddellik na behandeling is die helfte van die blare gesny en oorgedra na 'n verseëlde 4 ml-glasflessie, en die kopruimte is toegelaat om binne 5 uur op te bou. Tydens die meting is elke flessie vir 8 minute met 'n stroom van 2 liter/uur suiwer lug gespoel, wat voorheen deur 'n katalisator van Sensor Sense gegaan het om CO2 en water te verwyder.
Die mikroarray-data is oorspronklik gepubliseer in (35) en gestoor in die Nasionale Sentrum vir Biotegnologie-inligting (NCBI) se Geenekspressie-omvattende databasis (toegangsnommer GSE30287). Die data wat ooreenstem met die blare wat veroorsaak is deur die W + OSM-behandeling en die onbeskadigde kontrole is vir hierdie studie onttrek. Die rou intensiteit is log2. Voor statistiese analise is die basislyn omgeskakel en genormaliseer na sy 75ste persentiel met behulp van die R-sagtewarepakket.
Die oorspronklike RNA-volgordebepaling (RNA-volgordebepaling) data van Nicotiana spesies is verkry uit die NCBI Short Reading Archives (SRA), projeknommer is PRJNA301787, wat deur Zhou et al. (39) gerapporteer is en gaan voort soos beskryf in (56). Die rou data verwerk deur W + W, W + OSM en W + OSS1 wat ooreenstem met Nicotiana spesies is gekies vir analise in hierdie studie, en verwerk op die volgende wyse: Eerstens is die rou RNA-volgordebepaling lesings omgeskakel na FASTQ formaat. HISAT2 skakel FASTQ om na SAM, en SAMtools skakel SAM lêers om na gesorteerde BAM lêers. StringTie word gebruik om geenekspressie te bereken, en die ekspressiemetode daarvan is dat daar fragmente per duisend basisfragmente per miljoen gevolgordebepaling transkripsiefragmente is.
Die Acclaim chromatografiese kolom (150 mm x 2.1 mm; deeltjiegrootte 2.2μm) wat in die analise gebruik is en die 4 mm x 4 mm beskermende kolom bestaan ​​uit dieselfde materiaal. Die volgende binêre gradiënt word in die Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) stelsel gebruik: 0 tot 0.5 minute, isokraties 90% A [gedeïoniseerde water, 0.1% (v/v) asetonitriel en 0.05% mieresuur], 10% B (Asetonitriel en 0.05% mieresuur); 0.5 tot 23.5 minute, die gradiëntfase is onderskeidelik 10% A en 90% B; 23.5 tot 25 minute, isokraties 10% A en 90% B. Die vloeitempo is 400μl/min. Vir alle MS-ontledings, spuit die kolomeluent in 'n kwadrupool- en vlugtyd-(qTOF)-ontleder toegerus met 'n elektrosproeibron wat in positiewe ionisasiemodus werk (kapillêre spanning, 4500 V; kapillêre uitlaat 130 V; droogtemperatuur 200°C; drooglugvloei 10 liter/min).
Voer MS/MS-fragmentanalise (hierna verwys as MS/MS) uit wat irrelevant of ononderskeibaar is van die data om strukturele inligting oor die algehele waarneembare metaboliese profiel te verkry. Die konsep van die onoordeelkundige MS/MS-metode berus op die feit dat die kwadrupool 'n baie groot massa-isolasievenster het [beskou dus alle massa-tot-ladingverhouding (m/z) seine as fragmente]. Om hierdie rede, omdat die Impact II-instrument nie 'n CE-kanteling kon skep nie, is verskeie onafhanklike ontledings uitgevoer met behulp van verhoogde botsing-geïnduseerde dissosiasiebotsingsenergie (CE) waardes. Kortliks, analiseer eers die monster deur UHPLC-elektrosproei-ionisasie/qTOF-MS met behulp van enkelmassaspektrometriemodus (lae fragmentasietoestande gegenereer deur in-bron fragmentasie), skandering van m/z 50 tot 1500 teen 'n herhalingsfrekwensie van 5 Hz. Gebruik stikstof as die botsingsgas vir MS/MS-analise, en voer onafhanklike metings uit by die volgende vier verskillende botsingsgeïnduseerde dissosiasiespannings: 20, 30, 40 en 50 eV. Dwarsdeur die meetproses het die kwadrupool die grootste massa-isolasievenster, van m/z 50 tot 1500. Wanneer die voorste liggaam m/z en isolasiewydte-eksperiment op 200 gestel is, word die massabereik outomaties geaktiveer deur die instrument se bedryfsagteware en 0 Da. Skandeer vir massafragmente soos in enkelmassamodus. Gebruik natriumformiaat (50 ml isopropanol, 200 μl mieresuur en 1 ml 1M NaOH-waterige oplossing) vir massakalibrasie. Deur die hoë-presisie kalibrasie-algoritme te gebruik, word die datalêer gekalibreer nadat die gemiddelde spektrum in 'n gegewe tydperk uitgevoer is. Gebruik die uitvoerfunksie van Data Analysis v4.0 sagteware (Brook Dalton, Bremen, Duitsland) om die rou datalêers na NetCDF-formaat om te skakel. Die MS/MS-datastel is gestoor in die oop metabolomika-databasis MetaboLights (www.ebi.ac.uk) met die toegangsnommer MTBLS1471.
MS/MS-samestelling kan gerealiseer word deur korrelasie-analise tussen MS1- en MS/MS-kwaliteitsseine vir lae en hoë botsingsenergie en nuut geïmplementeerde reëls. Die R-skrip word gebruik om die korrelasie-analise van die verspreiding van die voorloper tot die produk te realiseer, en die C#-skrip (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) word gebruik om die reëls te implementeer.
Om vals positiewe foute wat veroorsaak word deur agtergrondgeraas en vals korrelasie wat veroorsaak word deur die opsporing van sekere m/z-kenmerke in slegs 'n paar monsters te verminder, gebruik ons ​​die "gevulde piek"-funksie van die R-pakket XCMS (vir agtergrondgeraaskorreksie). Dit moet gebruik word om die "NA" (onopgespoorde piek) intensiteit te vervang. Wanneer die vulpiekfunksie gebruik word, is daar steeds baie "0" intensiteitswaardes in die datastel wat die korrelasieberekening sal beïnvloed. Dan vergelyk ons ​​die dataverwerkingsresultate wat verkry word wanneer die gevulde piekfunksie gebruik word en wanneer die gevulde piekfunksie nie gebruik word nie, en bereken die agtergrondgeraaswaarde gebaseer op die gemiddelde gekorrigeerde beraamde waarde, en vervang dan hierdie 0 intensiteitswaardes met die berekende agtergrondwaarde. Ons het ook slegs kenmerke oorweeg waarvan die intensiteit drie keer die agtergrondwaarde oorskry het en dit as "ware pieke" beskou. Vir PCC-berekeninge word slegs die m/z-seine van die monstervoorloper (MS1) en fragmentdatastelle met ten minste agt ware pieke oorweeg.
Indien die intensiteit van die voorloper-kwaliteitskenmerk in die hele monster beduidend gekorreleer is met die verminderde intensiteit van dieselfde kwaliteitskenmerk wat aan lae of hoë botsingsenergie onderwerp word, en die kenmerk nie deur CAMERA as 'n isotooppiek gemerk word nie, kan dit verder gedefinieer word. Dan, deur alle moontlike voorloper-produk pare binne 3 s (die beraamde retensietydvenster vir piekretensie) te bereken, word die korrelasie-analise uitgevoer. Slegs wanneer die m/z-waarde laer is as die voorloperwaarde en MS/MS-fragmentasie in dieselfde monsterligging in die datastel voorkom as die voorloper waaruit dit afgelei is, word dit as 'n fragment beskou.
Gebaseer op hierdie twee eenvoudige reëls, sluit ons die gespesifiseerde fragmente met m/z-waardes groter as die m/z van die geïdentifiseerde voorloper uit, en gebaseer op die monsterposisie waar die voorloper verskyn en die gespesifiseerde fragment. Dit is ook moontlik om die kwaliteitskenmerke wat gegenereer word deur baie in-bron fragmente wat in MS1-modus gegenereer word, as kandidaat voorlopers te kies, waardeur oorbodige MS/MS-verbindings gegenereer word. Om hierdie data-oortolligheid te verminder, indien die NDP-ooreenkoms van die spektra 0.6 oorskry, en hulle behoort aan die chromatogram "pcgroep" wat deur CAMERA geannoteer is, sal ons hulle saamsmelt. Laastens, voeg ons al vier CE-resultate wat met die voorloper en fragmente geassosieer word, saam in die finale gedekonvoluteerde saamgestelde spektrum deur die hoogste intensiteitspiek onder alle kandidaatpieke met dieselfde m/z-waarde by verskillende botsingsenergieë te kies. Die daaropvolgende verwerkingsstappe is gebaseer op die konsep van saamgestelde spektrum en neem die verskillende CE-toestande in ag wat nodig is om die waarskynlikheid van fragmentasie te maksimeer, omdat sommige fragmente slegs onder 'n spesifieke botsingsenergie opgespoor kan word.
RDPI (30) is gebruik om die induseerbaarheid van die metaboliese profiel te bereken. Die metaboliese spektrumdiversiteit (Hj-indeks) word afgelei van die oorvloed van MS/MS-voorlopers deur die Shannon-entropie van die MS/MS-frekwensieverspreiding te gebruik met behulp van die volgende vergelyking wat deur Martínez et al. (8) beskryf word. Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) waar Pij ooreenstem met die relatiewe frekwensie van die i-de MS/MS in die j-de monster (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Metaboliese spesifisiteit (Si-indeks) word gedefinieer as die uitdrukkingsidentiteit van 'n gegewe MS/MS in verhouding tot die frekwensie tussen die monsters wat oorweeg word. MS/MS-spesifisiteit word bereken as Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Gebruik die volgende formule om die metaboloom-spesifieke δj-indeks van elke j-monster te meet, en die gemiddelde van MS/MS-spesifisiteit δj = ∑i = 1mPijSi
MS/MS-spektra word in pare in lyn gebring, en die ooreenkoms word bereken op grond van die twee tellings. Eerstens, deur gebruik te maak van standaard NDP (ook bekend as die kosinuskorrelasiemetode), gebruik die volgende vergelyking om die segmentooreenkoms tussen spektra te bepaal: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 waar S1 en S2. Ooreenstemmend, vir spektrum 1 en spektrum 2, sowel as WS1, i en WS2, verteenwoordig i die gewig gebaseer op die piekintensiteit waar die verskil van die i-de gemeenskaplike piek tussen die twee spektra minder as 0.01 Da is. Die gewig word soos volg bereken: W = [piekintensiteit] m [kwaliteit] n, m = 0.5, n = 2, soos voorgestel deur MassBank.
'n Tweede puntetellingsmetode is geïmplementeer, wat die ontleding van die gedeelde NL tussen MS/MS behels het. Vir hierdie doel het ons die 52 NL-lyste wat gereeld tydens die MS-fragmenteringsproses teëgekom word, in tandem gebruik, en die meer spesifieke NL (datalêer S1) wat voorheen geannoteer is vir die MS/MS-spektrum van die sekondêre metaboliete van die verswakte Nepenthes-spesies (9, 26). Skep 'n binêre vektor van 1 en 0 vir elke MS/MS, wat ooreenstem met die huidige en nie-bestaande van sommige NL onderskeidelik. Gebaseer op die Euklidiese afstandooreenkoms, word die NL-ooreenkomstelling bereken vir elke paar binêre NL-vektore.
Om dubbele groepering uit te voer, het ons die R-pakket DiffCoEx gebruik, wat gebaseer is op 'n uitbreiding van Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA). Deur die NDP- en NL-tellingmatrikse van MS/MS-spektra te gebruik, het ons DiffCoEx gebruik om die vergelykende korrelasiematriks te bereken. Binêre groepering word uitgevoer deur die "cutreeDynamic"-parameter te stel op method = "hybrid", cutHeight = 0.9999, deepSplit = T, en minClusterSize = 10. Die R-bronkode van DiffCoEx is afgelaai vanaf bykomende lêer 1 deur Tesson et al. (57); Die vereiste R WGCNA-sagtewarepakket kan gevind word in https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Om MS/MS molekulêre netwerkanalise uit te voer, het ons gepaarde spektrale konnektiwiteit bereken gebaseer op NDP- en NL-ooreenkomstipes, en Cytoscape-sagteware gebruik om netwerktopologie te visualiseer deur gebruik te maak van organiese uitleg in die CyFilescape yFiles-uitlegalgoritme-uitbreidingstoepassing.
Gebruik R weergawe 3.0.1 om statistiese analise op die data uit te voer. Statistiese beduidendheid is bepaal deur middel van tweerigting-variansie-analise (ANOVA), gevolg deur Tukey se eerlik beduidende verskil (HSD) post-hoc-toets. Om die verskil tussen die herbivore behandeling en die kontrole te analiseer, is die tweesydige verspreiding van die twee groepe monsters met dieselfde variansie geanaliseer met behulp van Student se t-toets.
Vir aanvullende materiaal vir hierdie artikel, sien asseblief http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Hierdie is 'n ooptoegangartikel wat versprei word onder die bepalings van die Creative Commons Attribution-Nie-Kommersiële Lisensie, wat die gebruik, verspreiding en reproduksie in enige medium toelaat, solank die finale gebruik nie vir kommersiële gewin is nie en die uitgangspunt is dat die oorspronklike werk korrek is. Verwysing.
Let wel: Ons vra jou slegs om jou e-posadres te verskaf sodat die persoon wat jy aanbeveel vir die bladsy weet dat jy wil hê hulle moet die e-pos sien en dat dit nie strooipos is nie. Ons sal geen e-posadresse vasvang nie.
Hierdie vraag word gebruik om te toets of jy 'n besoeker is en om outomatiese strooipos-indiening te voorkom.
Inligtingsteorie bied 'n universele geldeenheid vir die vergelyking van spesiale metabolome en die voorspelling van toetsverdedigingsteorieë.
Inligtingsteorie bied 'n universele geldeenheid vir die vergelyking van spesiale metabolome en die voorspelling van toetsverdedigingsteorieë.
©2021 American Association for the Advancement of Science. alle regte voorbehou. AAAS is 'n vennoot van HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.