Ons het voorheen berig dat serumvlakke van die derm-afgeleide triptofaanmetaboliet indool-3-propioonsuur (IPA) laer is in pasiënte met lewerfibrose. In hierdie studie het ons die transkriptoom en DNA-metiloom in vetsugtige lewers ondersoek in verhouding tot serum-IPA-vlakke, sowel as die rol van IPA in die induksie van fenotipiese inaktivering van hepatiese stellaatselle (HSC's) in vitro.
Die studie het 116 vetsugtige pasiënte sonder tipe 2-diabetes mellitus (T2DM) (ouderdom 46.8 ± 9.3 jaar; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) ingesluit wat bariatriese chirurgie by die Kuopio Bariatriese Chirurgie Sentrum (KOBS) ondergaan het. Sirkulerende IPA-vlakke is gemeet deur vloeistofchromatografie-massaspektrometrie (LC-MS), lewertranskriptoomanalise is uitgevoer deur totale RNS-volgordebepaling, en DNS-metileringsanalise is uitgevoer met behulp van die Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Menslike hepatiese stellaatselle (LX-2) is gebruik vir in vitro-eksperimente.
Serum IPA-vlakke het gekorreleer met die uitdrukking van gene betrokke by apoptotiese, mitofagiese en langlewendheidspaaie in die lewer. Die AKT serien/treonienkinase 1 (AKT1) geen was die volopste en dominantste interaktiewe geen in die lewertranskrip en DNA-metileringsprofiele. IPA-behandeling het apoptose veroorsaak, mitochondriale respirasie verminder en selmorfologie en mitochondriale dinamika verander deur die uitdrukking van gene wat bekend is om fibrose, apoptose en oorlewing van LX-2-selle te reguleer, te moduleer.
Saamgevat ondersteun hierdie data dat IPA potensiële terapeutiese effekte het en apoptose kan veroorsaak en die HSC-fenotipe na 'n onaktiewe toestand kan verskuif, waardeur die moontlikheid om lewerfibrose te inhibeer deur in te meng met HSC-aktivering en mitochondriale metabolisme, uitgebrei word.
Die voorkoms van vetsug en metaboliese sindroom is geassosieer met 'n toenemende voorkoms van metabolies geassosieerde vetterige lewersiekte (MASLD); die siekte affekteer 25% tot 30% van die algemene bevolking [1]. Die hoofgevolg van MASLD-etiologie is lewerfibrose, 'n dinamiese proses wat gekenmerk word deur voortdurende ophoping van veselagtige ekstrasellulêre matriks (ECM) [2]. Die hoofselle wat betrokke is by lewerfibrose is hepatiese stellaatselle (HSC's), wat vier bekende fenotipes vertoon: rustig, geaktiveerd, geïnaktiveerd en senescent [3, 4]. HSC's kan geaktiveer word en transdifferensieer van 'n rustige vorm na proliferatiewe fibroblast-agtige selle met hoë energiebehoeftes, met verhoogde uitdrukking van α-gladde spieraktien (α-SMA) en tipe I kollageen (Col-I) [5, 6]. Tydens lewerfibrose-omkering word geaktiveerde HSC's uitgeskakel via apoptose of inaktivering. Hierdie prosesse sluit in die afregulering van fibrogeniese gene en die modulasie van pro-oorlewingsgene (soos NF-κB en PI3K/Akt seinweë) [7, 8], sowel as veranderinge in mitochondriale dinamika en funksie [9].
Serumvlakke van die triptofaanmetaboliet indool-3-propioensuur (IPA), wat in die ingewande geproduseer word, is gevind om verlaag te wees in menslike metaboliese siektes, insluitend MASLD [10-13]. IPA word geassosieer met dieetveselinname, is bekend vir sy antioksidant- en anti-inflammatoriese effekte, en verswak die dieet-geïnduseerde nie-alkoholiese steatohepatitis (NASH) fenotipe in vivo en in vitro [11-14]. Sommige bewyse kom uit ons vorige studie, wat getoon het dat serum IPA-vlakke laer was by pasiënte met lewerfibrose as by vetsugtige pasiënte sonder lewerfibrose in die Kuopio Bariatriese Chirurgiestudie (KOBS). Verder het ons getoon dat IPA-behandeling die uitdrukking van gene wat klassieke merkers van seladhesie, selmigrasie en hematopoïetiese stamselaktivering in 'n menslike hepatiese stellaatsel (LX-2) model is, kan verminder en 'n potensiële hepatopobeskermende metaboliet is [15]. Dit bly egter onduidelik hoe IPA lewerfibrose-regressie veroorsaak deur HSC-apoptose en mitochondriale bio-energetika te aktiveer.
Hier demonstreer ons dat serum IPA geassosieer word met die uitdrukking van gene wat verryk is in apoptose, mitofagie en langlewendheidspaaie in die lewer van vetsugtige, maar nie-tipe 2-diabetes (KOBS) individue. Verder het ons gevind dat IPA die klaring en afbraak van geaktiveerde hematopoïetiese stamselle (HSC's) via die inaktiveringsroete kan veroorsaak. Hierdie resultate toon 'n nuwe rol vir IPA, wat dit 'n potensiële terapeutiese teiken maak om lewerfibrose-regressie te bevorder.
'n Vorige studie in die KOBS-kohort het getoon dat pasiënte met lewerfibrose laer sirkulerende IPA-vlakke gehad het in vergelyking met pasiënte sonder lewerfibrose [15]. Om die potensiële verwarrende effek van tipe 2-diabetes uit te sluit, het ons 116 vetsugtige pasiënte sonder tipe 2-diabetes (gemiddelde ouderdom ± SD: 46,8 ± 9,3 jaar; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Tabel 1) uit die voortgesette KOBS-studie as die studiepopulasie gewerf [16]. Alle deelnemers het skriftelike ingeligte toestemming gegee en die studieprotokol is goedgekeur deur die Etiekkomitee van die Noord-Savo County Hospitaal in ooreenstemming met die Verklaring van Helsinki (54/2005, 104/2008 en 27/2010).
Lewerbiopsie-monsters is tydens bariatriese chirurgie verkry en histologies deur ervare patoloë beoordeel volgens voorheen beskryfde kriteria [17, 18]. Die assesseringskriteria word opgesom in Aanvullende Tabel S1 en is voorheen beskryf [19].
Vastende serummonsters is geanaliseer deur ongeteikende vloeistofchromatografie-massaspektrometrie (LC-MS) vir metabolomika-analise (n = 116). Monsters is geanaliseer met behulp van 'n UHPLC-qTOF-MS-stelsel (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Duitsland) soos voorheen beskryf19. Identifikasie van isopropylalkohol (IPA) was gebaseer op retensietyd en vergelyking van die MS/MS-spektrum met suiwer standaarde. Die IPA-seinintensiteit (piekarea) is in alle verdere analises in ag geneem [20].
RNS-volgordebepaling van die hele lewer is uitgevoer met behulp van Illumina HiSeq 2500 en data is vooraf verwerk soos voorheen beskryf [19, 21, 22]. Ons het geteikende differensiële ekspressie-analise van transkripsies wat mitochondriale funksie/biogenese beïnvloed, uitgevoer met behulp van 1957 gene wat uit die MitoMiner 4.0-databasis gekies is [23]. Lewer-DNS-metileringsanalise is uitgevoer met behulp van die Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, VSA) met behulp van dieselfde metodologie as voorheen beskryf [24, 25].
Menslike hepatiese stellaatselle (LX-2) is vriendelik verskaf deur Prof. Stefano Romeo en is gekweek en in stand gehou in DMEM/F12-medium (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Om die werksdosis IPA te kies, is LX-2-selle vir 24 uur met verskillende konsentrasies IPA (10 μM, 100 μM en 1 mM; Sigma, 220027) in DMEM/F12-medium behandel. Verder, om die vermoë van IPA om HSC's te inaktiveer te ondersoek, is LX-2-selle vir 24 uur saam met 5 ng/ml TGF-β1 (R&D-stelsels, 240-B-002/CF) en 1 mM IPA in serumvrye medium behandel. Vir die ooreenstemmende kontroles is 4 nM HCL wat 0.1% BSA bevat, gebruik vir TGF-β1-behandeling en 0.05% DMSO vir IPA-behandeling, en albei is saam gebruik vir die kombinasiebehandeling.
Apoptose is geassesseer met behulp van die FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit met 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, VSA, Kat# 640922) volgens die vervaardiger se instruksies. Kortliks, LX-2 (1 × 105 selle/put) is oornag in 12-putplate gekweek en toe behandel met veelvuldige dosisse IPA of IPA en TGF-β1. Die volgende dag is drywende en aanhegtende selle versamel, getripsiniseer, met PBS gewas, in Annexin V-bindingsbuffer hersuspendeer en vir 15 minute met FITC-Annexin V en 7-AAD geïnkubeer.
Mitochondria in lewende selle is gekleur vir oksidatiewe aktiwiteit met behulp van Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Vir MTR-toetse is LX-2-selle by gelyke digthede met IPA en TGF-β1 geïnkubeer. Na 24 uur is lewende selle getripsiniseer, met PBS gewas en dan met 100 μM MTR in serumvrye medium by 37 °C vir 20 minute geïnkubeer soos voorheen beskryf [26]. Vir lewende selmorfologie-analise is selgrootte en sitoplasmiese kompleksiteit geanaliseer met behulp van onderskeidelik voorwaartse verstrooiings- (FSC) en syverspreidings- (SSC) parameters.
Alle data (30 000 gebeurtenisse) is verkry met behulp van NovoCyte Quanteon (Agilent) en geanaliseer met behulp van NovoExpress® 1.4.1- of FlowJo V.10-sagteware.
Suurstofverbruikstempo (OCR) en ekstrasellulêre versuringstempo (ECAR) is intyds gemeet met behulp van 'n Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) toegerus met 'n Seahorse XF Cell Mito Stress volgens die vervaardiger se instruksies. Kortliks, 2 × 104 LX-2 selle/put is op XF96 selkultuurplate gesaai. Na oornag inkubasie is selle behandel met isopropanol (IPA) en TGF-β1 (Aanvullende Metodes 1). Data-analise is uitgevoer met behulp van Seahorse XF Wave sagteware, wat die Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator insluit. Hieruit is 'n Bioenergetiese Gesondheidsindeks (BHI) bereken [27].
Totale RNA is in cDNA getranskribeer. Vir spesifieke metodes, sien verwysing [15]. Menslike 60S ribosomale suur proteïen P0 (RPLP0) en siklofilien A1 (PPIA) mRNA-vlakke is as konstitutiewe geenkontroles gebruik. Die QuantStudio 6 pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher, Landsmeer, Nederland) is saam met die TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) of die Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) gebruik, en relatiewe geenekspressievou is bereken met behulp van vergelykende Ct-waarde-siklusparameters (ΔΔCt) en die ∆∆Ct-metode. Besonderhede van die primers word in Aanvullende Tabelle S2 en S3 verskaf.
Kern-DNS (ncDNS) en mitochondriale DNS (mtDNS) is geëkstraheer met behulp van die DNeasy-bloed- en weefselkit (Qiagen) soos voorheen beskryf [28]. Die relatiewe hoeveelheid mtDNS is bereken deur die verhouding van elke teiken-mtDNS-streek tot die geometriese gemiddelde van die drie kern-DNS-streke (mtDNS/ncDNS) te bereken, soos uiteengesit in Aanvullende Metodes 2. Besonderhede van die primers vir mtDNS en ncDNS word in Aanvullende Tabel S4 verskaf.
Lewende selle is gekleur met Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) om intersellulêre en intrasellulêre mitochondriale netwerke te visualiseer. LX-2-selle (1 × 104 selle/put) is op glasplaatjies in ooreenstemmende glasbodem-kweekplate gekweek (Ibidi GmbH, Martinsried, Duitsland). Na 24 uur is lewende LX-2-selle vir 20 minute by 37 °C met 100 μM MTR geïnkubeer en selkerne is gekleur met DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) soos voorheen beskryf [29]. Mitochondriale netwerke is gevisualiseer met behulp van 'n Zeiss Axio Observer omgekeerde mikroskoop (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Duitsland) toegerus met 'n Zeiss LSM 800 konfokale module by 37 °C in 'n bevogtigde atmosfeer met 5% CO2 met behulp van 'n 63×NA 1.3 objektief. Ons het tien Z-reeks beelde vir elke monstertipe verkry. Elke Z-reeks bevat 30 afdelings, elk met 'n dikte van 9.86 μm. Vir elke monster is beelde van tien verskillende gesigsvelde verkry met behulp van ZEN 2009 sagteware (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Duitsland), en mitochondriale morfologie-analise is uitgevoer met behulp van ImageJ sagteware (v1.54d) [30, 31] volgens die parameters wat in Aanvullende Metodes 3 uiteengesit word.
Die selle is gefikseer met 2% glutaraldehied in 0.1 M fosfaatbuffer, gevolg deur fiksasie met 1% osmiumtetroksiedoplossing (Sigma Aldrich, MO, VSA), geleidelik gedehidreer met asetoon (Merck, Darmstadt, Duitsland), en uiteindelik in epoksiehars ingebed. Ultradun snitte is voorberei en gekleur met 1% uranielasetaat (Merck, Darmstadt, Duitsland) en 1% loodsitraat (Merck, Darmstadt, Duitsland). Ultrastrukturele beelde is verkry met behulp van 'n JEM 2100F EXII transmissie-elektronmikroskoop (JEOL Bpk., Tokio, Japan) teen 'n versnellende spanning van 80 kV.
Die morfologie van LX-2-selle wat vir 24 uur met IPA behandel is, is geanaliseer deur fasekontrasmikroskopie teen 50x vergroting met behulp van 'n Zeiss-omgekeerde ligmikroskoop (Zeiss Axio Vert.A1 en AxioCam MRm, Jena, Duitsland).
Kliniese data is uitgedruk as gemiddelde ± standaardafwyking of mediaan (interkwartielreeks: IQR). Eenrigting-variansie-analise (kontinue veranderlikes) of χ²-toets (kategoriese veranderlikes) is gebruik om die verskille tussen die drie studiegroepe te vergelyk. Die vals positiewe koers (FDR) is gebruik om vir veelvuldige toetse te korrigeer, en gene met FDR < 0.05 is as statisties beduidend beskou. Spearman-korrelasie-analise is gebruik om CpG-DNA-metilering met IPA-seinintensiteit te korreleer, met nominale p-waardes (p < 0.05) gerapporteer.
Padanalise is uitgevoer met behulp van 'n web-gebaseerde geenstel-analise-instrument (WebGestalt) vir 268 transkripsies (nominale p < 0.01), 119 mitochondria-geassosieerde transkripsies (nominale p < 0.05), en 4350 CpG's uit 3093 lewertranskripte wat geassosieer was met sirkulerende serum IPA-vlakke. Die vrylik beskikbare Venny DB (weergawe 2.1.0) instrument is gebruik om oorvleuelende gene te vind, en StringDB (weergawe 11.5) is gebruik om proteïen-proteïen-interaksies te visualiseer.
Vir die LX-2-eksperiment is monsters vir normaliteit getoets met behulp van die D'Agostino-Pearson-toets. Data is verkry van ten minste drie biologiese replikate en onderwerp aan eenrigting-ANOVA met Bonferroni post hoc-toets. 'n P-waarde van minder as 0.05 is as statisties beduidend beskou. Data word aangebied as gemiddeld ± SD, en die aantal eksperimente word in elke figuur aangedui. Alle ontledings en grafieke is uitgevoer met behulp van GraphPad Prism 8 statistiese sagteware vir Windows (GraphPad Software Inc., weergawe 8.4.3, San Diego, VSA).
Eerstens het ons die assosiasie van serum IPA-vlakke met lewer-, heelliggaam- en mitochondriale transkripsies ondersoek. In die totale transkripprofiel was die sterkste geen wat met serum IPA-vlakke geassosieer word MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; mitogeen-geaktiveerde proteïenkinase-geaktiveerde proteïenkinase 3); in die mitochondria-verwante transkripprofiel was die sterkste geassosieerde geen AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serien/treonienkinase 1) (Bykomende lêer 1 en Bykomende lêer 2).
Ons het toe globale transkripsies (n = 268; p < 0.01) en mitochondria-geassosieerde transkripsies (n = 119; p < 0.05) geanaliseer, en uiteindelik apoptose as die belangrikste kanonieke pad geïdentifiseer (p = 0.0089). Vir mitochondriale transkripsies wat met serum IPA-vlakke geassosieer word, het ons gefokus op apoptose (FDR = 0.00001), mitofagie (FDR = 0.00029), en TNF-seinweë (FDR = 0.000006) (Figuur 1A, Tabel 2, en Aanvullende Figure 1A-B).
Oorvleuelende analise van globale, mitochondria-geassosieerde transkripsies, en DNA-metilering in menslike lewer in assosiasie met serum IPA-vlakke. A verteenwoordig 268 globale transkripsies, 119 mitochondria-geassosieerde transkripsies, en DNA-gemetileerde transkripsies wat gekarteer is na 3092 CpG-plekke wat geassosieer word met serum IPA-vlakke (p-waardes < 0.01 vir globale transkripsies en DNA-gemetileerde, en p-waardes < 0.05 vir mitochondriale transkripsies). Die belangrikste oorvleuelende transkripsies word in die middel getoon (AKT1 en YKT6). B Die interaksiekaart van die 13 gene met die hoogste interaksietelling (0.900) met ander gene is saamgestel uit die 56 oorvleuelende gene (swart lynstreek) wat beduidend geassosieer was met serum IPA-vlakke met behulp van die aanlyn hulpmiddel StringDB. Groen: Gene gekarteer na die Gene Ontology (GO) sellulêre komponent: mitochondria (GO:0005739). AKT1 is die proteïen met die hoogste telling (0.900) vir interaksies met ander proteïene gebaseer op die data (gebaseer op teksontginning, eksperimente, databasisse en ko-ekspressie). Netwerkknope verteenwoordig proteïene, en rande verteenwoordig verbindings tussen proteïene.
Aangesien derm-mikrobiota-metaboliete epigenetiese samestelling deur DNA-metilering kan reguleer [32], het ons ondersoek ingestel of serum-IPA-vlakke geassosieer is met lewer-DNS-metilering. Ons het gevind dat die twee hoofmetileringsplekke wat met serum-IPA-vlakke geassosieer word, naby prolien-serien-ryke streek 3 (C19orf55) en hitteskokproteïenfamilie B (klein) lid 6 (HSPB6) was (Bykomende lêer 3). DNA-metilering van 4350 CpG (p < 0.01) was gekorreleer met serum-IPA-vlakke en was verryk in langlewendheidsregulerende paaie (p = 0.006) (Figuur 1A, Tabel 2, en Aanvullende Figuur 1C).
Om die biologiese meganismes onderliggend aan die assosiasies tussen serum IPA-vlakke, globale transkripsies, mitochondria-geassosieerde transkripsies en DNA-metilering in die menslike lewer te verstaan, het ons 'n oorvleuelingsanalise uitgevoer van die gene wat in die vorige padanalise geïdentifiseer is (Figuur 1A). Die resultate van padverrykingsanalise van die 56 oorvleuelende gene (binne die swart lyn in Figuur 1A) het getoon dat die apoptose-pad (p = 0.00029) twee gene uitgelig het wat algemeen is vir die drie analises: AKT1 en YKT6 (YKT6 v-SNARE-homoloog), soos getoon in die Venn-diagram (Aanvullende Figuur 2 en Figuur 1A). Interessant genoeg het ons gevind dat AKT1 (cg19831386) en YKT6 (cg24161647) positief gekorreleer was met serum IPA-vlakke (Bykomende lêer 3). Om potensiële proteïeninteraksies tussen geenprodukte te identifiseer, het ons 13 gene met die hoogste gemeenskaplike streektelling (0.900) onder 56 oorvleuelende gene as invoer gekies en 'n interaksiekaart gekonstrueer. Volgens die vertrouensvlak (marginale vertroue) was die AKT1-geen met die hoogste telling (0.900) bo-aan (Figuur 1B).
Gebaseer op die padanalise, het ons gevind dat apoptose die hoofpad was, daarom het ons ondersoek ingestel of IPA-behandeling die apoptose van HSC's in vitro sou beïnvloed. Ons het voorheen gedemonstreer dat verskillende dosisse IPA (10 μM, 100 μM en 1 mM) nie-toksies vir LX-2-selle was [15]. Hierdie studie het getoon dat IPA-behandeling teen 10 μM en 100 μM die aantal lewensvatbare en nekrotiese selle verhoog het. In vergelyking met die kontrolegroep het sel-lewensvatbaarheid egter afgeneem teen 'n 1 mM IPA-konsentrasie, terwyl die selskrokrosetempo onveranderd gebly het (Figuur 2A, B). Vervolgens, om die optimale konsentrasie te vind om apoptose in LX-2-selle te induseer, het ons 10 μM, 100 μM en 1 mM IPA vir 24 uur getoets (Figuur 2A-E en Aanvullende Figuur 3A-B). Interessant genoeg het IPA 10 μM en 100 μM die apoptosekoers (%) verlaag, maar IPA 1 mM het laat apoptose en apoptosekoers (%) verhoog in vergelyking met die kontrole en is dus gekies vir verdere eksperimente (Figure 2A–D).
IPA veroorsaak apoptose van LX-2-selle. Annexin V en 7-AAD dubbelkleuringsmetode is gebruik om die apoptotiese tempo en selmorfologie te kwantifiseer deur vloeisitometrie. BA-selle is geïnkubeer met 10 μM, 100 μM en 1 mM IPA vir 24 uur of met F–H TGF-β1 (5 ng/ml) en 1 mM IPA in serumvrye medium vir 24 uur. A: lewende selle (Annexin V -/ 7AAD-); B: nekrotiese selle (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: vroeg (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: laat (Annexin V+/7AAD.+); E, H: persentasie van totale vroeë en laat apoptotiese selle in apoptotiese tempo (%). Data word uitgedruk as gemiddeld ± SD, n = 3 onafhanklike eksperimente. Statistiese vergelykings is uitgevoer met behulp van eenrigting-ANOVA met Bonferroni post hoc-toets. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Soos ons voorheen getoon het, kan 5 ng/ml TGF-β1 HSC-aktivering veroorsaak deur die uitdrukking van klassieke merkergene te verhoog [15]. LX-2-selle is behandel met 5 ng/ml TGF-β1 en 1 mM IPA in kombinasie (Fig. 2E–H). TGF-β1-behandeling het nie die apoptose-tempo verander nie, maar IPA-gekombineerde behandeling het laat apoptose en apoptose-tempo (%) verhoog in vergelyking met TGF-β1-behandeling (Fig. 2E–H). Hierdie resultate dui daarop dat 1 mM IPA apoptose in LX-2-selle onafhanklik van TGF-β1-induksie kan bevorder.
Ons het verder die effek van IPA op mitochondriale respirasie in LX-2-selle ondersoek. Die resultate het getoon dat 1 mM IPA die suurstofverbruikstempo (OCR) parameters verminder het: nie-mitochondriale respirasie, basale en maksimale respirasie, protonlekkasie en ATP-produksie in vergelyking met die kontrolegroep (Figuur 3A, B), terwyl die bio-energetiese gesondheidsindeks (BHI) nie verander het nie.
IPA verminder mitochondriale respirasie in LX-2-selle. Die mitochondriale respirasiekurwe (OCR) word aangebied as mitochondriale respirasieparameters (nie-mitochondriale respirasie, basale respirasie, maksimale respirasie, protonlekkasie, ATP-generasie, SRC en BHI). Selle A en B is onderskeidelik met 10 μM, 100 μM en 1 mM IPA vir 24 uur geïnkubeer. Selle C en D is onderskeidelik met TGF-β1 (5 ng/ml) en 1 mM IPA in serumvrye medium vir 24 uur geïnkubeer. Alle metings is genormaliseer na DNA-inhoud met behulp van die CyQuant-kit. BHI: bio-energetiese gesondheidsindeks; SRC: respiratoriese reserwekapasiteit; OCR: suurstofverbruikstempo. Data word aangebied as gemiddelde ± standaardafwyking (SD), n = 5 onafhanklike eksperimente. Statistiese vergelykings is uitgevoer met behulp van eenrigting-ANOVA en Bonferroni post hoc-toets. *p < 0.05; **p < 0.01; en ***p < 0.001
Om 'n meer omvattende begrip van die effek van IPA op die bio-energetiese profiel van TGF-β1-geaktiveerde LX-2-selle te verkry, het ons mitochondriale oksidatiewe fosforilering deur OCR geanaliseer (Fig. 3C, D). Die resultate het getoon dat TGF-β1-behandeling die maksimum respirasie, respiratoriese reserwekapasiteit (SRC) en BHI kon verminder in vergelyking met die kontrolegroep (Fig. 3C, D). Daarbenewens het die kombinasiebehandeling basale respirasie, protonlekkasie en ATP-produksie verminder, maar SRC en BHI was beduidend hoër as dié wat met TGF-β1 behandel is (Fig. 3C, D).
Ons het ook die "Sellulêre Energie Fenotipe Toets" uitgevoer wat deur Seahorse sagteware verskaf word (Aanvullende Fig. 4A-D). Soos getoon in Aanvullende Fig. 3B, was beide OCR en ECAR metaboliese potensiale verlaag na TGF-β1 behandeling, maar geen verskil is waargeneem in die kombinasie en IPA behandeling groepe in vergelyking met die kontrole groep nie. Verder was beide basale en stresvlakke van OCR verlaag na kombinasie en IPA behandeling in vergelyking met die kontrole groep (Aanvullende Fig. 4C). Interessant genoeg is 'n soortgelyke patroon waargeneem met kombinasie terapie, waar geen verandering in basale en stresvlakke van ECAR waargeneem is in vergelyking met TGF-β1 behandeling nie (Aanvullende Fig. 4C). In HSCs het die vermindering in mitochondriale oksidatiewe fosforilering en die vermoë van kombinasie behandeling om SCR en BHI te herstel na blootstelling aan TGF-β1 behandeling nie die metaboliese potensiaal (OCR en ECAR) verander nie. Saamgevat dui hierdie resultate daarop dat IPA bio-energetika in HSCs kan verminder, wat daarop dui dat IPA 'n laer energieprofiel kan veroorsaak wat die HSC fenotipe na inaktivering verskuif (Aanvullende Fig. 4D).
Die effek van IPA op mitochondriale dinamika is ondersoek deur gebruik te maak van driedimensionele kwantifisering van mitochondriale morfologie en netwerkverbindings, sowel as MTR-kleuring (Figuur 4 en Aanvullende Figuur 5). Figuur 4 toon dat, in vergelyking met die kontrolegroep, TGF-β1-behandeling die gemiddelde oppervlakarea, taknommer, totale taklengte en takaansluitingsnommer (Figuur 4A en B) verminder het en die proporsie mitochondria van sferiese na intermediêre morfologie verander het (Figuur 4C). Slegs IPA-behandeling het die gemiddelde mitochondriale volume verminder en die proporsie mitochondria van sferiese na intermediêre morfologie verander in vergelyking met die kontrolegroep (Figuur 4A). In teenstelling hiermee het sferisiteit, gemiddelde taklengte en mitochondriale aktiwiteit, wat deur mitochondriale membraanpotensiaal-afhanklike MTR (Figuur 4A en E) beoordeel is, onveranderd gebly en hierdie parameters het nie tussen groepe verskil nie. Saamgevat dui hierdie resultate daarop dat TGF-β1- en IPA-behandeling blykbaar mitochondriale vorm en grootte sowel as netwerkkompleksiteit in lewende LX-2-selle moduleer.
IPA verander mitochondriale dinamika en mitochondriale DNS-oorvloed in LX-2-selle. A. Verteenwoordigende konfokale beelde van lewende LX-2-selle geïnkubeer met TGF-β1 (5 ng/ml) en 1 mM IPA vir 24 uur in serumvrye medium wat mitochondriale netwerke toon wat gekleur is met Mitotracker™ Red CMXRos en kerne wat blou gekleur is met DAPI. Alle data het ten minste 15 beelde per groep bevat. Ons het 10 Z-stapelbeelde vir elke monstertipe verkry. Elke Z-as-volgorde het 30 snye bevat, elk met 'n dikte van 9.86 μm. Skaalbalk: 10 μm. B. Verteenwoordigende voorwerpe (slegs mitochondria) geïdentifiseer deur aanpasbare drempelwaardes op die beeld toe te pas. Kwantitatiewe analise en vergelyking van mitochondriale morfologiese netwerkverbindings is vir alle selle in elke groep uitgevoer. C. Frekwensie van mitochondriale vormverhoudings. Waardes naby 0 dui sferiese vorms aan, en waardes naby 1 dui filamentagtige vorms aan. D Mitochondriale DNS (mtDNS) inhoud is bepaal soos beskryf in Materiale en Metodes. E Mitotracker™ Rooi CMXRos-analise is uitgevoer deur vloeisitometrie (30 000 gebeurtenisse) soos beskryf in Materiale en Metodes. Data word aangebied as gemiddeld ± SD, n = 3 onafhanklike eksperimente. Statistiese vergelykings is uitgevoer met behulp van eenrigting-ANOVA en Bonferroni post hoc-toets. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Ons het toe die mtDNA-inhoud in LX-2-selle as 'n aanduiding van mitochondriale aantal geanaliseer. In vergelyking met die kontrolegroep, was die mtDNA-inhoud verhoog in die TGF-β1-behandelde groep (Figuur 4D). In vergelyking met die TGF-β1-behandelde groep, was die mtDNA-inhoud verlaag in die kombinasiebehandelingsgroep (Figuur 4D), wat daarop dui dat IPA die mtDNA-inhoud en moontlik die mitochondriale aantal sowel as mitochondriale respirasie kan verminder (Figuur 3C). Boonop het IPA die mtDNA-inhoud in die kombinasiebehandeling verminder, maar het nie MTR-gemedieerde mitochondriale aktiwiteit beïnvloed nie (Figure 4A-C).
Ons het die assosiasie van IPA met die mRNA-vlakke van gene wat geassosieer word met fibrose, apoptose, oorlewing en mitochondriale dinamika in LX-2-selle ondersoek (Figuur 5A–D). In vergelyking met die kontrolegroep het die TGF-β1-behandelde groep verhoogde uitdrukking van gene soos kollageen tipe I α2-ketting (COL1A2), α-gladde spieraktien (αSMA), matriksmetalloproteïnase 2 (MMP2), weefselinhibeerder van metalloproteïnase 1 (TIMP1), en dinamien 1-agtige geen (DRP1) getoon, wat dui op verhoogde fibrose en aktivering. Verder, in vergelyking met die kontrolegroep, het TGF-β1-behandeling die mRNA-vlakke van kernpregnaan X-reseptor (PXR), kaspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibeerder van B-sel α, versterker van kernfaktor κ geen ligpeptied (NFκB1A), en inhibeerder van kernfaktor κB kinase subeenheid β (IKBKB) verminder (Figuur 5A–D). In vergelyking met TGF-β1-behandeling, het kombinasiebehandeling met TGF-β1 en IPA die uitdrukking van COL1A2 en MMP2 verminder, maar die mRNA-vlakke van PXR, TIMP1, B-sel limfoom-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β en IKBKB verhoog. IPA-behandeling het die uitdrukking van MMP2, Bcl-2-geassosieerde proteïen X (BAX), AKT1, optiese atrofieproteïen 1 (OPA1) en mitochondriale fusieproteïen 2 (MFN2) aansienlik verminder, terwyl die uitdrukking van CASP8, NFκB1A, NFκB1B en IKBKB verhoog is in vergelyking met die kontrolegroep. Geen verskil is egter gevind in die uitdrukking van caspase-3 (CASP3), apoptotiese peptidase-aktiverende faktor 1 (APAF1), mitochondriale fusieproteïen 1 (MFN1) en fisieproteïen 1 (FIS1) nie. Gesamentlik dui hierdie resultate daarop dat IPA-behandeling die uitdrukking van gene wat verband hou met fibrose, apoptose, oorlewing en mitochondriale dinamika moduleer. Ons data dui daarop dat IPA-behandeling fibrose in LX-2-selle verminder; terselfdertyd stimuleer dit oorlewing deur die fenotipe na inaktivering te verskuif.
IPA moduleer die uitdrukking van fibroblast-, apoptotiese-, lewensvatbaarheids- en mitochondriale dinamika-gene in LX-2-selle. Histogramme toon mRNA-uitdrukking relatief tot endogene beheer (RPLP0 of PPIA) nadat LX-2-selle vir 24 uur met TGF-β1 en IPA in serumvrye medium geïnduseer is. A dui fibroblaste aan, B dui apoptotiese selle aan, C dui oorlewende selle aan, en D dui mitochondriale dinamika-geenuitdrukking aan. Data word aangebied as gemiddelde ± standaardafwyking (SD), n = 3 onafhanklike eksperimente. Statistiese vergelykings is uitgevoer met behulp van eenrigting-ANOVA en Bonferroni post hoc-toets. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Daarna is veranderinge in selgrootte (FSC-H) en sitoplasmiese kompleksiteit (SSC-H) deur vloeisitometrie geassesseer (Figuur 6A,B), en veranderinge in selmorfologie na IPA-behandeling is deur transmissie-elektronmikroskopie (TEM) en fasekontrasmikroskopie geassesseer (Aanvullende Figuur 6A-B). Soos verwag, het selle in die TGF-β1-behandelde groep in grootte toegeneem in vergelyking met die kontrolegroep (Figuur 6A,B), wat die klassieke uitbreiding van growwe endoplasmiese retikulum (ER*) en fagolisome (P) toon, wat dui op hematopoïetiese stamsel (HSC) aktivering (Aanvullende Figuur 6A). In vergelyking met die TGF-β1-behandelde groep, was die selgrootte, sitoplasmiese kompleksiteit (Fig. 6A,B) en ER*-inhoud egter afgeneem in die TGF-β1 en IPA kombinasie behandelingsgroep (Aanvullende Fig. 6A). Verder het IPA-behandeling die selgrootte, sitoplasmiese kompleksiteit (Fig. 6A,B), P en ER*-inhoud (Aanvullende Fig. 6A) verminder in vergelyking met die kontrolegroep. Daarbenewens het die inhoud van apoptotiese selle toegeneem na 24 uur van IPA-behandeling in vergelyking met die kontrolegroep (wit pyle, Aanvullende Fig. 6B). Gesamentlik dui hierdie resultate daarop dat 1 mM IPA HSC-apoptose kan stimuleer en die veranderinge in selmorfologiese parameters wat deur TGF-β1 geïnduseer word, kan omkeer, waardeur die selgrootte en -kompleksiteit gereguleer word, wat moontlik met HSC-inaktivering geassosieer word.
IPA verander selgrootte en sitoplasmiese kompleksiteit in LX-2-selle. Verteenwoordigende beelde van vloeisitometrie-analise. Die analise het 'n poortstrategie spesifiek vir LX-2-selle gebruik: SSC-A/FSC-A om die selpopulasie te definieer, FSC-H/FSC-A om dubbeltjies te identifiseer, en SSC-H/FSC-H vir selgrootte- en kompleksiteitsanalise. Selle is vir 24 uur met TGF-β1 (5 ng/ml) en 1 mM IPA in serumvrye medium geïnkubeer. LX-2-selle is versprei in die onderste linkerkwadrant (SSC-H-/FSC-H-), boonste linkerkwadrant (SSC-H+/FSC-H-), onderste regterkwadrant (SSC-H-/FSC-H+), en boonste regterkwadrant (SSC-H+/FSC-H+) vir selgrootte- en sitoplasmiese kompleksiteitsanalise. B. Selmorfologie is deur vloeisitometrie geanaliseer met behulp van FSC-H (voorwaartse verstrooiing, selgrootte) en SSC-H (syverspreiding, sitoplasmiese kompleksiteit) (30 000 gebeurtenisse). Data word aangebied as gemiddelde ± SD, n = 3 onafhanklike eksperimente. Statistiese vergelykings is uitgevoer met behulp van eenrigting-ANOVA en Bonferroni post hoc-toets. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 en ****p < 0.0001
Dermmetaboliete soos IPA het 'n warm onderwerp van navorsing geword, wat daarop dui dat nuwe teikens in die dermmikrobiota ontdek kan word. Dit is dus interessant dat IPA, 'n metaboliet wat ons gekoppel het aan lewerfibrose in mense [15], in diermodelle as 'n potensiële anti-fibrotiese verbinding getoon is [13, 14]. Hier demonstreer ons vir die eerste keer 'n verband tussen serum IPA en globale lewertranskriptomika en DNA-metilering in vetsugtige individue sonder tipe 2-diabetes (T2D), wat apoptose, mitofagie en langlewendheid beklemtoon, sowel as 'n moontlike kandidaatgeen AKT1 wat lewerhomeostase reguleer. Nog 'n nuwigheid van ons studie is dat ons die interaksie van IPA-behandeling met apoptose, selmorfologie, mitochondriale bio-energetika en dinamika in LX-2-selle gedemonstreer het, wat 'n laer energiespektrum aandui wat die HSC-fenotipe na inaktivering verskuif, wat IPA 'n potensiële kandidaat maak vir die verbetering van lewerfibrose.
Ons het bevind dat apoptose, mitofagie en langlewendheid die belangrikste kanonieke bane was wat verryk is in lewergene wat geassosieer word met sirkulerende serum IPA. Ontwrigting van die mitochondriale kwaliteitsbeheer (MQC) stelsel kan lei tot mitochondriale disfunksie, mitofagie en apoptose, wat die voorkoms van MASLD bevorder [33, 34]. Daarom kan ons spekuleer dat IPA betrokke kan wees by die handhawing van seldinamika en mitochondriale integriteit deur apoptose, mitofagie en langlewendheid in die lewer. Ons data het getoon dat twee gene algemeen was oor die drie toetse: YKT6 en AKT1. Dit is opmerklik dat YKT6 'n SNARE-proteïen is wat betrokke is by die proses van selmembraanfusie. Dit speel 'n rol in outofagie en mitofagie deur 'n inisiasiekompleks met STX17 en SNAP29 op die outofagosoom te vorm, wat die fusie van outofagosome en lisosome bevorder [35]. Verder lei die verlies van YKT6-funksie tot verswakte mitofagie[36], terwyl opregulering van YKT6 geassosieer word met die progressie van hepatosellulêre karsinoom (HCC), wat verhoogde seloorlewing toon[37]. Aan die ander kant is AKT1 die belangrikste interaktiewe geen en speel 'n belangrike rol in lewersiektes, insluitend die PI3K/AKT-seinweg, selsiklus, selmigrasie, proliferasie, fokale adhesie, mitochondriale funksie en kollageenafskeiding[38–40]. Die geaktiveerde PI3K/AKT-seinweg kan hematopoïetiese stamselle (HSC's) aktiveer, wat die selle is wat verantwoordelik is vir die produksie van ekstrasellulêre matriks (ECM), en die disregulering daarvan kan bydra tot die voorkoms en progressie van lewerfibrose[40]. Daarbenewens is AKT een van die belangrikste seloorlewingsfaktore wat p53-afhanklike sel-apoptose inhibeer, en AKT-aktivering kan geassosieer word met die inhibisie van lewersel-apoptose[41, 42]. Die verkrygde resultate dui daarop dat IPA betrokke kan wees by lewermitochondria-geassosieerde apoptose deur die besluit van hepatosiete tussen die aanvang van apoptose of oorlewing te beïnvloed. Hierdie effekte kan gereguleer word deur AKT- en/of YKT6-kandidaatgene, wat krities is vir lewerhomeostase.
Ons resultate het getoon dat 1 mM IPA apoptose veroorsaak het en mitochondriale respirasie in LX-2-selle verminder het, onafhanklik van TGF-β1-behandeling. Dit is noemenswaardig dat apoptose 'n belangrike pad vir fibrose-resolusie en hematopoïetiese stamsel (HSC) aktivering is, en ook 'n sleutelgebeurtenis in die omkeerbare fisiologiese reaksie van lewerfibrose is [4, 43]. Boonop het die herstel van BHI in LX-2-selle na kombinasiebehandeling nuwe insigte verskaf in die potensiële rol van IPA in die regulering van mitochondriale bio-energetika. Onder rustende en onaktiewe toestande gebruik hematopoïetiese selle normaalweg mitochondriale oksidatiewe fosforilering om ATP te produseer en het lae metaboliese aktiwiteit. Aan die ander kant verbeter HSC-aktivering mitochondriale respirasie en biosintese om te kompenseer vir die energiebehoeftes om die glikolitiese toestand te betree [44]. Die feit dat IPA nie metaboliese potensiaal en ECAR beïnvloed het nie, dui daarop dat die glikolitiese pad minder geprioritiseer word. Net so het 'n ander studie getoon dat 1 mM IPA in staat was om mitochondriale respiratoriese kettingaktiwiteit in kardiomiosiete, menslike hepatosiet-sellyn (Huh7) en menslike naelstring-endoteelselle (HUVEC) te moduleer; Geen effek van IPA is egter op glikolise in kardiomiosiete gevind nie, wat daarop dui dat IPA die bio-energetika van ander seltipes kan beïnvloed [45]. Daarom spekuleer ons dat 1 mM IPA as 'n ligte chemiese ontkoppelaar kan optree, aangesien dit fibrogeniese geen-ekspressie, selmorfologie en mitochondriale bio-energetika aansienlik kan verminder sonder om die hoeveelheid mtDNA te verander [46]. Mitochondriale ontkoppelaars kan kultuur-geïnduseerde fibrose en HSC-aktivering inhibeer [47] en mitochondriale ATP-produksie wat deur sekere proteïene soos ontkoppelproteïene (UCP) of adeniennukleotiedtranslokase (ANT) gereguleer of geïnduseer word, verminder. Afhangende van die seltipe, kan hierdie verskynsel selle teen apoptose beskerm en/of apoptose bevorder [46]. Verdere studies is egter nodig om die rol van IPA as 'n mitochondriale ontkoppelaar in hematopoïetiese stamselinaktivering te verduidelik.
Ons het toe ondersoek of die veranderinge in mitochondriale respirasie weerspieël word in mitochondriale morfologie in lewende LX-2-selle. Interessant genoeg verander TGF-β1-behandeling die mitochondriale proporsie van sferies na intermediêr, met verminderde mitochondriale vertakking en verhoogde uitdrukking van DRP1, 'n sleutelfaktor in mitochondriale splitsing [48]. Verder word mitochondriale fragmentasie geassosieer met algehele netwerkkompleksiteit, en die oorgang van fusie na splitsing is krities vir hematopoïetiese stamsel (HSC) aktivering, terwyl inhibisie van mitochondriale splitsing lei tot HSC-apoptose [49]. Dus dui ons resultate daarop dat TGF-β1-behandeling 'n afname in mitochondriale netwerkkompleksiteit met verminderde vertakking kan veroorsaak, wat meer algemeen voorkom in mitochondriale splitsing wat verband hou met geaktiveerde hematopoïetiese stamselle (HSC's). Verder het ons data getoon dat IPA die proporsie van mitochondria van sferiese na intermediêre vorm kan verander, waardeur die uitdrukking van OPA1 en MFN2 verminder word. Studies het getoon dat afregulering van OPA1 'n afname in mitochondriale membraanpotensiaal kan veroorsaak en sel-apoptose kan veroorsaak [50]. MFN2 is bekend daarvoor dat dit mitochondriale fusie en apoptose bemiddel [51]. Die verkrygde resultate dui daarop dat induksie van LX-2-selle deur TGF-β1 en/of IPA die mitochondriale vorm en grootte, sowel as die aktiveringstoestand en netwerkkompleksiteit, blyk te moduleer.
Ons resultate dui daarop dat die kombinasiebehandeling van TGFβ-1 en IPA mtDNA en selmorfologiese parameters kan verminder deur die mRNA-uitdrukking van fibrose, apoptose en oorlewingsverwante gene in apoptose-ontduikende selle te reguleer. IPA het inderdaad die mRNA-uitdrukkingsvlak van AKT1 en belangrike fibrosegene soos COL1A2 en MMP2 verlaag, maar die uitdrukkingsvlak van CASP8, wat met apoptose geassosieer word, verhoog. Ons resultate het getoon dat na IPA-behandeling BAX-uitdrukking afgeneem het en mRNA-uitdrukking van TIMP1-familie-subeenhede, BCL-2 en NF-κB toegeneem het, wat daarop dui dat IPA oorlewingsseine in hematopoïetiese stamselle (HSC's) wat apoptose ontduik, kan stimuleer. Hierdie molekules kan optree as pro-oorlewingsseine in geaktiveerde hematopoïetiese stamselle, wat geassosieer kan word met verhoogde uitdrukking van anti-apoptotiese proteïene (soos Bcl-2), verminderde uitdrukking van pro-apoptotiese BAX, en 'n komplekse wisselwerking tussen TIMP en NF-κB [5, 7]. IPA oefen sy effekte uit deur PXR, en ons het gevind dat kombinasiebehandeling met TGF-β1 en IPA PXR mRNA-ekspressievlakke verhoog het, wat dui op onderdrukking van HSC-aktivering. Geaktiveerde PXR-seintransduksie is bekend om HSC-aktivering beide in vivo en in vitro te inhibeer [52, 53]. Ons resultate dui daarop dat IPA kan deelneem aan die opruiming van geaktiveerde HSC's deur apoptose te bevorder, fibrose en mitochondriale metabolisme te verminder, en oorlewingsseine te verbeter, wat tipiese prosesse is wat die geaktiveerde HSC-fenotipe na 'n geïnaktiveerde een omskakel. Nog 'n moontlike verduideliking vir die potensiële meganisme en rol van IPA in apoptose is dat dit disfunksionele mitochondria hoofsaaklik deur mitofagie (intrinsieke pad) en die ekstrinsieke TNF-seintransduksiepad (Tabel 1) opruim, wat direk gekoppel is aan die NF-κB-oorlewingsseintransduksiepad (Aanvullende Figuur 7). Interessant genoeg is IPA-verwante verrykte gene in staat om pro-apoptotiese en pro-oorlewingsseine in die apoptotiese pad te induseer [54], wat daarop dui dat IPA die apoptotiese pad of oorlewing kan induseer deur interaksie met hierdie gene. Hoe IPA apoptose of oorlewing tydens HSC-aktivering veroorsaak en die meganistiese weë daarvan bly egter onduidelik.
IPA is 'n mikrobiese metaboliet wat gevorm word uit dieettriptofaan via die dermmikrobiota. Studies het getoon dat dit anti-inflammatoriese, antioksidant- en epigenetiese regulerende eienskappe in die dermomgewing het.[55] Studies het getoon dat IPA die dermversperringsfunksie kan moduleer en oksidatiewe stres kan verminder, wat kan bydra tot die plaaslike fisiologiese effekte daarvan.[56] Trouens, IPA word via die sirkulasie na teikenorgane vervoer, en aangesien IPA 'n soortgelyke hoofmetabolietstruktuur met triptofaan-, serotonien- en indoolderivate deel, oefen IPA metaboliese aksies uit wat lei tot mededingende metaboliese lotgevalle.[52] IPA kan met triptofaan-afgeleide metaboliete meeding vir bindingsplekke op ensieme of reseptore, wat moontlik normale metaboliese weë kan ontwrig. Dit beklemtoon die behoefte aan verdere studies oor die farmakokinetika en farmakodinamika daarvan om die terapeutiese venster daarvan beter te verstaan.[57] Dit bly nog gesien of dit ook in hematopoïetiese stamselle (HSC's) kan voorkom.
Ons erken dat ons studie sekere beperkings het. Om spesifiek assosiasies wat verband hou met IPA te ondersoek, het ons pasiënte met tipe 2-diabetes mellitus (T2DM) uitgesluit. Ons erken dat dit die breë toepaslikheid van ons bevindinge op pasiënte met tipe 2-diabetes mellitus en gevorderde lewersiekte beperk. Alhoewel die fisiologiese konsentrasie van IPA in menslike serum 1–10 μM is [11, 20], is 'n konsentrasie van 1 mM IPA gekies op grond van die hoogste nie-toksiese konsentrasie [15] en die hoogste tempo van apoptose, met geen verskil in die persentasie van die nekrotiese selpopulasie nie. Alhoewel suprafisiologiese vlakke van IPA in hierdie studie gebruik is, is daar tans geen konsensus oor die effektiewe dosis van IPA nie [52]. Alhoewel ons resultate beduidend is, bly die breër metaboliese lot van IPA 'n aktiewe navorsingsgebied. Boonop is ons bevindinge oor die assosiasie tussen serum IPA-vlakke en DNA-metilering van lewertranskripte nie net verkry van hematopoïetiese stamselle (HSC's) nie, maar ook van lewerweefsel. Ons het gekies om menslike LX-2-selle te gebruik gebaseer op ons vorige bevindinge van transkriptoom-analise dat IPA geassosieer word met hematopoïetiese stamsel (HSC) aktivering [15], en HSC's is die belangrikste selle wat betrokke is by die progressie van lewerfibrose. Die lewer bestaan ​​uit verskeie seltipes, daarom moet ander selmodelle soos die hepatosiet-HSC-immuunsel ko-kultuurstelsel gekombineer met kaspase-aktivering en DNA-fragmentasie, sowel as die werkingsmeganisme, insluitend proteïenvlak, oorweeg word om die rol van IPA en die interaksie daarvan met ander lewerseltipes te bestudeer.