Proteïensortering in die sekretoriese pad is noodsaaklik vir die handhawing van selkompartementalisering en homeostase. Benewens dop-gemedieerde sortering, is die rol van lipiede in kinesiensortering in die proses van sekretoriese vervoer 'n langstaande basiese vraag wat nog nie beantwoord is nie. Hier voer ons 3D gelyktydige veelkleurige hoë-resolusie intydse beelding uit om in vivo te bewys dat nuut gesintetiseerde glikosielfosfatidielinositol-geïmmobiliseerde proteïene met baie lang seramiedlipiedmolekules gegroepeer en geklassifiseer word in gespesialiseerde endoplasmas Net-uitgangsplek, wat verskil van dié wat deur transmembraanproteïene gebruik word. Daarbenewens toon ons dat die kettinglengte van seramied in die endoplasmiese retikulummembraan krities is vir hierdie sorteringselektiwiteit. Ons studie bied die eerste direkte in vivo bewyse om proteïenladings gebaseer op lipiedkettinglengte te klassifiseer in selektiewe uitvoerplekke in die sekretoriese pad.
In eukariotiese selle word die proteïene wat in die endoplasmiese retikulum (ER) gesintetiseer word, dan gesorteer tydens vervoer deur die sekretoriese pad vir aflewering na hul toepaslike sellulêre bestemming (1). Benewens mantel-gemedieerde sortering, is daar lank gespekuleer dat sekere lipiede ook as selektiewe uitgangspunte kan dien deur hulle in spesifieke membraandomeine te groepeer wat proteïene spesifiseer (2-5). Daar is egter steeds 'n gebrek aan direkte in vivo bewyse om hierdie moontlike lipied-gebaseerde meganisme te bewys. Om hierdie basiese probleem op te los, het ons in gis bestudeer hoe glikosielfosfatidielinositol (GPI) geankerde proteïene (GPI-AP's) differensieel vanaf die ER uitgevoer word. GPI-AP's is 'n verskeidenheid lipied-gekoppelde seloppervlakproteïene (6, 7). GPI-AP is 'n afgeskeide proteïen wat aan die buitenste pamflette van die plasmamembraan geheg is deur die glikolipied-deel (GPI-anker). Hulle aanvaar GPI-ankers as konserwatiewe post-translasionele modifikasies in die ER-lumen (8). Na aanhegting beweeg GPI-AP deur die Golgi-apparaat (5, 9) vanaf die ER na die plasmamembraan. Die teenwoordigheid van GPI-ankers veroorsaak dat GPI-AP afsonderlik van transmembraan-afskeide proteïene (insluitend ander plasmamembraanproteïene) langs die afskeidingsroete vervoer word (5, 9, 10). In gisselle word GPI-AP's van ander afskeide proteïene in die endoplasmiese retikulum geskei en dan verpak in unieke vesikels wat deur mantelproteïenkompleks II (COPII) toegedraai word (6, 7). Die determinante van hierdie klassifikasieproses in die ER-uitvoerproses is onduidelik, maar daar word gespekuleer dat hierdie meganisme lipiede mag vereis, veral die strukturele hermodellering van die lipiedgedeelte van die GPI-anker (5, 8). In gis begin GPI-lipiedhermodellering onmiddellik nadat die GPI aanheg, en in baie gevalle veroorsaak dit dat seramied aan die 26-koolstof langketting versadigde vetsuur (C26:0) bind (11, 12). C26-seramied is die hoofseramied wat tot dusver deur gisselle geproduseer word. Dit word in die ER gesintetiseer en die meeste daarvan word na die Golgi-apparaat uitgevoer deur COPII-vesikels (13). Die ER-uitvoer van GPI-AP vereis spesifiek voortdurende seramiedsintese (14, 15), en op sy beurt hang die omskakeling van seramied na inositolfosfaatseramied (IPC) in die Golgi-apparaat af van GPI-ankersintese (16). Biofisiese studies met kunsmatige membrane het getoon dat baie lang asielketting-seramiede kan saamvloei om geordende domeine met unieke fisiese eienskappe te vorm (17, 18). Hierdie data lei tot die hipotese dat C26-seramied en GPI-AP met C26-seramied hul fisiese eienskappe gebruik om saam te vloei in ordelike streke of streke in die relatief morsige ER-membraanlipiedomgewing. Dit bestaan ​​hoofsaaklik uit kort en onversadigde gliserolipiede (C16:1 en C18:1) (19, 20). Hierdie streke sal selektief gefokus wees op spesifieke ER-uitgangsplekke (ERES), waar seramied en seramied-gebaseerde GPI-AP saam na die Golgi vervoer kan word in dieselfde toegewyde COPII-vesikel (5).
In hierdie studie het ons hierdie lipied-gebaseerde meganisme direk getoets deur gebruik te maak van superresolusie-konfokale intydse beeldmikroskopie (SCLIM), wat 'n baanbrekende mikroskopietegniek is wat gelyktydig fluoresserend gemerkte proteïene kan waarneem. Die driekleur- en driedimensionele (3D) beelde het uiters hoë resolusie en spoed in lewende selle (21, 22).
Ons het eers SCLIM-tegnologie toegepas om verder te definieer hoe normale GPI-AP met die C26-seramiedgroep gekeur is uit transmembraan-afskeide proteïene nadat dit die ER in S. cerevisiae verlaat het. Om die klassifikasie van ER na te gaan, het ons 'n genetiese stelsel gebruik wat nuut gesintetiseerde vrag wat ERES binnedring direk in vivo kan visualiseer (7, 23). As vrag het ons C26-seramied-gebaseerde GPI-AP Gas1 gemerk met groen fluorescerende proteïen (GFP) en transmembraan-afskeide proteïen Mid2 gemerk met nabye-infrarooi fluorescerende proteïen (iRFP) gekies, wat albei die plasmamembraan teiken (24-26). In die sec31-1 temperatuursensitiewe mutant word hierdie twee vragte uitgedruk onder 'n galaktose-induseerbare promotor en 'n konstitutiewe ERES-merker. By die uiterste temperatuur (37°C), omdat die sec31-1-mutasie die funksie van COPII-laagkomponent Sec31 beïnvloed om COPII-ontkieming en ER-uitvoer te inhibeer, versamel nuut gesintetiseerde vrag by die ER (23). Na afkoeling tot 'n lae temperatuur (24°C), het die sec31-1-mutantselle van die sekretoriese area herstel, en die opgehoopte nuwe sintetiese lading het begin om van die ER uitgevoer te word. CLIM-visualisering het getoon dat die meeste van die nuut gesintetiseerde Gas1-GFP en Mid2-iRFP steeds in die ER van die sec31-1-mutantselle opgehoop het na inkubasie by 37°C en dan vir 5 minute by 24°C vrygestel is (Figuur 1). Aangesien Mid2-iRFP oor die hele ER-membraan versprei is, en Gas1-GFP gekonsentreer en versamel is in die diskontinue ER-membraanarea, is hul verspreiding heeltemal anders (Figuur 1, A tot C en Film S1). Daarbenewens, soos getoon in Figuur 1D, het die Gas1-GFP-groep nie Mid2-iRFP nie. Hierdie resultate dui daarop dat GPI-AP en transmembraanproteïene vroeg in verskillende ER-membraanstreke geskei is. Die Gas1-GFP-groep is aangrensend aan 'n spesifieke ERES wat gemerk is met mCherry se COPII-omhulselproteïen Sec13 (Figuur 1, E en F, en film S1) (23).
sec31-1-selle druk galaktose-geïnduseerde afskeidings uit, 'n lang asielketting (C26) seramied GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, groen) en die transmembraanproteïen Mid2-iRFP (TMP, blou) en hierdie Konstruktiewe ERES-etikettering Sec13-mCherry (ERES, magenta) is vir 30 minute by 37°C geïnkubeer, na 24°C verskuif en 5 minute later deur SCLIM afgebeeld. (A tot C) toon 'n verteenwoordigende saamgevoegde of enkele 2D-beeld van 'n vlak (A), 'n 2D-projeksiebeeld van 10 z-snitte (B) of 'n 3D-selhemisfeerbeeld van lading en ERES-merkers (C). Skaalbalk 1μm (A en B). Die skaaleenheid is 0.551μm (C). Gas1-GFP is in afsonderlike ER-streke of -groepe opgespoor, terwyl Mid2-iRFP opgespoor en deur die ER-membraan versprei is (C). (D) Die grafiek toon die relatiewe fluoresensie-intensiteit van Gas1-GFP en Mid2-iRFP in die Gas1-GFP-groep langs die wit pyllyn (links). AU, arbitrêre eenheid. (E en F) verteenwoordig die 3D-beeld wat die goedere- en ERES-merk kombineer. Gas1-GFP-groepe is naby die spesifieke ERES opgespoor. Die skaaleenheid is 0.551 μm. (F) Die wit soliede pyl merk die Gas1-GFP-groep wat met ERES geassosieer word. Die middelste en regterpanele toon die saamgevoegde vergrote 3D-beeld en 'n geroteerde aansig van die gekose Gas1-GFP-groep.
Die noue ruimtelike verhouding tussen die Gas1-GFP-groep en 'n spesifieke ERES dui daarop dat Gas1-GFP selektiewe ERES kan binnedring, wat verskil van die selektiwiteit wat deur Mid2-iRFP gebruik word om die ER te verlaat. Om hierdie moontlikheid aan te spreek, het ons die ERES-verhouding vir slegs een of twee goedere gekwantifiseer (Figuur 2, A tot C). Ons het gevind dat die meeste ERES (70%) slegs een tipe vrag bevat. Die onderste beeld van Figuur 2C toon twee tipiese voorbeelde van ERES met slegs Gas1-GFP (Figuur 1) of slegs Mid2-iRFP (Figuur 2). In teenstelling hiermee bevat ongeveer 20% van ERES twee vragte wat in dieselfde area oorvleuel. Daar is gevind dat sommige ERES (10%) twee tipes vrag bevat het, maar hulle was in duidelik verskillende gebiede geïsoleer. Daarom toon hierdie statistiese analise dat nadat die ER uitgevoer is, GPI-AP Gas1-GFP en die transmembraanvrag Mid2-iRFP in verskillende ERES verdeel word (Figuur 2D). Hierdie sorteerdoeltreffendheid stem baie ooreen met die vorige biochemiese analise (6) en morfologiese bepaling (7). Ons kan ook die gedrag van die kwarantynvrag wat ERES binnedring, waarneem (Figuur 2E en Film S2). Figuur 2E toon dat slegs 'n klein gedeelte van Gas1-GFP (paneel 3) of Mid2-iRFP (paneel 4) die ERES van een kant binnedring en in 'n afsonderlike area beperk is. Paneel 5 van Figuur 2E toon dat Gas1-GFP en Mid2-iRFP soms in dieselfde ERES gevind word, maar hulle kom van verskillende kante binne en is gekonsentreer in aparte streke wat verskillende COPII-vesikels kan verteenwoordig. Ons het ook bevestig dat die waargenome skeiding en klassifikasie van C26-seramied-gebaseerde GPI-AP Gas1 as selektiewe ERES spesifiek is omdat 'n ander transmembraan-sekresievrag, die GFP-gemerkte plasmamembraanproteïen Axl2 (27), soortgelyke gedrag as Mid2-iRFP toon. (Foto S1 en Film S3). Die nuut gesintetiseerde Axl2-GFP word deur die ER-membraan versprei soos Mid2-iRFP (Figuur S1, A en B), en is saam met Mid2-iRFP in die meeste ERES'e gelokaliseer (Figuur S1, B tot D). Panele 1 en 2 van Figuur 1. S1C toon twee tipiese voorbeelde van ERES waar twee transmembraanvragte oorvleuel. In hierdie gevalle gaan beide goedere ERES saam binne (Figuur S1E, Paneel 3 en Rolprent S3).
Die sec31-1-selle wat galaktose-induseerbare afskeidings uitdruk, Gas1-GFP (GPI-AP, groen) en Mid2-iRFP (TMP, blou) en konstitutiewe ERES-etikettering Sec13-mCherry (ERES, magenta) is by 37 °C geplaas. Nadat dit vir 30 minute by °C geïnkubeer is, skuif dit na 24 °C om die afskeidingsblok vry te stel, en neem 'n beeld met SCLIM na 20 minute. (A tot C) Verteenwoordigende 2D-projeksiebeelde (A; skaalbalk, 1 μm) of 3D-selhemisfeerbeelde (B en C; skaaleenheid, 0.456 μm) van die vrag en 10 z-snitte gemerk met ERES. Die onderste paneel in (B) en die paneel in (C) vertoon verwerkte beelde om slegs die goedere wat in ERES teenwoordig is (magenta) [Gas1-GFP (grys) en Mid2-iRFP (ligblou)] te vertoon. (C) Oop pyl: ERES dra slegs een stuk vrag (1 tot 4). Grys ​​pyl: ERES bevat gesegregeerde vrag (5). Wit soliede pyl: ERES wat saamgeplaasde vrag bevat. Onder: Die gekose enkele ERES bevat slegs Gas1-GFP (1) of Mid2-iRFP (2). Skaalbalk, 100 nm. (D) Kwantifisering van die fotomikrograaf beskryf in (C). Die gemiddelde persentasie ERES wat slegs een vrag (Gas1-GFP of Mid2-iRFP), gesegregeerde vrag en oorvleuelende vrag bevat. In drie onafhanklike eksperimente, n = 432 in 54 selle. Foutbalk = SD. Tweesydige ongepaarde t-toets. *** P = 0.0002. (E) 3D-beeld van gekose ERES van kwarantynvrag gemerk met (C). Gas1-GFP (groen) (3) of Mid2-iRFP (blou) (4) gaan ERES (magenta) van een kant af binne en is beperk tot 'n klein area binne ERES. Soms gaan beide tipes vrag dieselfde ERES (5) van dieselfde kant af binne en is beperk tot 'n geïsoleerde area binne die ERES. Skaalbalk, 100 nm.
Vervolgens het ons 'n hipotese getoets dat die lang asielketting-seramied (C26) wat in die ER-membraan teenwoordig is, die spesifieke groepering en sortering van Gas1 in selektiewe ERES dryf. Vir hierdie doel het ons 'n gemodifiseerde gisstam GhLag1 gebruik, waarin die twee endogene seramiedsintases Lag1 en Lac1 vervang is deur GhLag1 (die Lag1-homoloog van katoen), wat 'n gisstam met 'n selmembraan-seramiedstam korter as die wilde tipe tot gevolg gehad het (Figuur 3A) (28). Massaspektrometrie (MS)-analise het getoon dat in wilde tipe stamme 95% van die totale seramied baie lang (C26) ketting-seramied is, terwyl in GhLag1 85% van die seramied baie lank is (C18 en C16), slegs 2% van die seramied is baie lang (C26) ketting-seramied. Alhoewel C18- en C16-seramiede die hoofseramiede is wat tot dusver in die GhLag1-membraan opgespoor is, het MS-analise ook bevestig dat die GPI-anker van Gas1-GFP wat in die GhLag1-stam uitgedruk word, C26-seramied bevat, wat vergelykbaar is met wildetipe-lipiede. Die kwaliteit is dieselfde (Fig. 3A) (26). Dit beteken dus dat die seramied-hermodelleringsensiem Cwh43 hoogs selektief is vir C26-seramied, soos getoon in Figuur 26, dit inkorporeer verkieslik die GPI-anker van 'n klein hoeveelheid C26-seramied in die GhLag1-stam. S2 (29). Nietemin bevat die selmembraan van GhLag1 basies slegs C18-C16-seramied, terwyl Gas1-GFP steeds C26-seramied het. Hierdie feit maak hierdie stam 'n ideale instrument om spesifiek die probleem van die asielkettinglengte van membraan-seramied in die ER op te los. Die hipotetiese rol van klas en sortering. Daarna het ons eers die vermoë van C26 Gas1-GFP bestudeer om in trosse in GhLag1 met 'n temperatuursensitiewe mutant-alleel van sec31-1 op te hoop deur middel van konvensionele fluoresensiemikroskopie, waar slegs die lang (C18-C16) ketting in die ER-membraan Ceramide bestaan ​​(Fig. 3). Ons het waargeneem dat in sec31-1 die meeste van Gas1-GFP in trosse gekonsentreer was, terwyl Gas1-GFP in sec31-1 GhLag1 met lang (C18-C16) lang seramied-ER-membraan hoofsaaklik nie gegroepeer en versprei was in die hele ER-membraan nie. Om presies te wees, omdat C26-seramied-gebaseerde groepering nou verwant is aan spesifieke ERES (Figuur 1), het ons vervolgens ondersoek ingestel of hierdie proses ook die funksie van die ER-uitvoerproteïenmeganisme kan betrek. GPI-AP gebruik 'n spesiale COPII-stelsel vir ER-uitvoer, wat aktief gereguleer word deur Ted1 se strukturele hermodellering van die glikaangedeelte van die GPI-anker (30, 31). Die rekombinante GPI-glikaan word dan herken deur die transmembraan-vragreseptor p24-kompleks, wat weer selektief Lst1 werf, wat 'n spesifieke isovorm van die hoof COPII-vragbindingsubeenheid Sec24 is, wat 'n GPI-AP-ryke COPII vorm. Vesikels is nodig (31-33). Daarom het ons 'n dubbelmutant gekonstrueer wat die verwydering van hierdie enkele proteïene (die p24-komplekskomponent Emp24, GPI-glikaan-hermodelleringsensiem Ted1 en die spesifieke COPII-subeenheid Lst1) met die sec31-1-mutantstam gekombineer het, en bestudeer of dit moontlik is om Gas1-kluster GFP te vorm (Figuur 3). Ons het waargeneem dat in sec31-1emp24Δ en sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP hoofsaaklik ongeklusterd en versprei is deur die ER-membraan, soos voorheen gesien in sec31-1 GhLag1, terwyl in sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Soos sec31-1. Hierdie resultate dui daarop dat benewens die teenwoordigheid van C26-seramied in die ER-membraan, die groepering van Gas1-GFP ook aan die p24-kompleks moet bind, en nie spesifieke Lst1-werwing vereis nie. Daarna het ons die moontlikheid ondersoek dat die kettinglengte van seramied in die ER-membraan die binding van Gas1-GFP aan p24 kan reguleer. Ons het egter gevind dat die teenwoordigheid van C18-C16-seramied in die membraan nie die GPI-glikane wat deur die p24-kompleks gerekonstrueer word (Figure S3 en S4, A en B) of die binding aan GPI-AP en die uitvoervermoë van GPI-AP beïnvloed nie. Werwing van COPII-subtipe Lst1 (Figuur S4C). Daarom vereis C26-seramied-afhanklike groepering nie proteïeninteraksies met verskillende ER-uitvoerproteïenmeganismes nie, maar ondersteun 'n alternatiewe sorteermeganisme wat deur lipiedlengte gedryf word. Daarna het ons geanaliseer of die seramied-asielkettinglengte in die ER-membraan belangrik is vir die effektiewe klassifikasie van Gas1-GFP as selektiewe ERES. Aangesien Gas1 in die GhLag1-stam met kortketting-seramied die ER verlaat en die plasmamembraan binnedring (Figuur S5), glo ons dat as die sortering gedryf word deur die lengte van die seramied-asielketting, die Gas1 in die GhLag1-stam herlei en gekruis kan word. ERES-goedere met dieselfde membraan.
(A) Die selmembraan van GhLag1 bevat hoofsaaklik korter C18-C16 seramiede, terwyl die GPI-anker van Gas1-GFP steeds dieselfde C26 IPC as wildetipe selle het. Bo: asielkettinglengte-analise van seramied in die selmembraan van wildetipe (Wt) en GhLag1p-stamme deur massaspektrometrie (MS). Die data verteenwoordig die persentasie totale seramied. Die gemiddelde van drie onafhanklike eksperimente. Foutbalk = SD. Tweesydige ongepaarde t-toets. **** P <0.0001. Onderste paneel: MS-analise van die asielkettinglengte van die IPC teenwoordig in die Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI-anker uitgedruk in die wildetipe en GhLag1p-stamme. Die data verteenwoordig die persentasie totale IPC-sein. Gemiddeld van vyf onafhanklike eksperimente. Foutbalk = SD. Tweesydige ongepaarde t-toets. ns, nie belangrik nie. P = 0.9134. (B) Fluoresensiemikrograwe van sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ en sec31-1lst1Δ selle wat galaktose-geïnduseerde Gas1-GFP uitdruk, is vir 30 minute by 37°C geïnkubeer en na 24°C deurgegee. Voer roetine-fluoresensiemikroskopie uit. Wit pyl: ER Gas1-GFP-tros. Oop pyl: Ongetrosterde Gas1-GFP is oor die hele ER-membraan versprei, wat die kenmerkende ER-kernringkleuring toon. Skaalbalk, 5μm. (C) Kwantifisering van die fotomikrograaf beskryf in (B). Die gemiddelde persentasie selle met gepunteerde Gas1-GFP-struktuur. In drie onafhanklike eksperimente, n≥300 selle. Foutbalk = SD. Tweesydige ongepaarde t-toets. **** P <0.0001.
Om hierdie probleem direk op te los, het ons SCLIM-visualisering van Gas1-GFP en Mid2-iRFP in GhLag1 met die sec31-1 temperatuursensitiewe mutant-alleel uitgevoer (Figuur 4 en Film S4). Nadat die ER by 37°C behou is en daarna by 24°C vrygestel is, was die meeste van die nuut gesintetiseerde Gas1-GFP nie gegroepeer en versprei deur die ER-membraan nie, soos waargeneem deur konvensionele mikroskope (Figuur 4, A en B). Daarbenewens bevat 'n groot persentasie ERES (67%) twee tipes lading wat saam daarin geleë is (Figuur 4D). Panele 1 en 2 van Figuur 4C toon twee tipiese voorbeelde van ERES met oorvleuelende Gas1-GFP en Mid2-GFP. Daarbenewens is beide goedere in dieselfde ERES gewerf (Figuur 4E, paneel 3 en film S4). Daarom dui ons resultate daarop dat die lengte van die seramied-asielketting in die ER-membraan 'n belangrike bepaler van ER-proteïenaggregasie en -klassifikasie is.
Sec31-1 GhLag1-selle wat galaktose-geïnduseerde afskeidings uitdruk, Gas1-GFP (GPI-AP, groen) en Mid2-iRFP (TMP, blou) en konstitutiewe ERES-gemerkte Sec13-mCherry (ERES, magenta). Inkubeer by 37°C. Gaan voort vir 30 minute, verlaag tot 24°C om afskeidings vry te stel, en neem 'n beeld met SCLIM na 20 minute. (A tot C) Verteenwoordigende 2D-projeksiebeelde (A; skaalbalk, 1μm) of 3D-selhemisfeerbeelde (B en C; skaaleenheid, 0.45μm) van die 10 z-seksies gemerk deur lading en ERES. Die onderste paneel in (B) en die paneel in (C) vertoon verwerkte beelde om slegs die goedere teenwoordig in ERES (magenta) te vertoon [Gas1-GFP (grys) en Mid2-iRFP (ligblou)]. (C) Wit gevulde pyl: ERES, goedere oorvleuel. Oop pyltjie: ERES bevat slegs een item. Onderste paneel: Die gekose ERES het oorvleuelende goedere (1 en 2) gemerk in (C). Skaalbalk, 100 nm. (D) Kwantifisering van die fotomikrograaf beskryf in (C). In die sec31-1 en sec31-1 GhLag1 eenhede is slegs een vrag (Gas1-GFP of Mid2-iRFP) ingesluit, en die gemiddelde persentasie ERES vir geïsoleerde vrag en oorvleuelende vrag. In drie onafhanklike eksperimente, n = 432 in 54 selle (sec31-1) en n = 430 in 47 selle (sec31-1 GhLag1). Foutbalk = SD. Tweesydige ongepaarde t-toets. *** P = 0.0002 (sec31-1) en ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D-beeld van gekose ERES met oorvleuelende vrag (3) gemerk in (C). Gas1-GFP (groen) en Mid2-iRFP (blou) nader ERES (magenta) vanaf dieselfde kant en bly in dieselfde ERES-beperkte area. Skaalbalk, 100 nm.
Hierdie studie verskaf direkte in vivo bewyse dat lipied-gebaseerde proteïenladings geklassifiseer word in selektiewe uitvoerplekke in die sekretoriese pad, en onthul die belangrikheid van asielkettinglengte vir klassifikasieselektiwiteit. Deur 'n kragtige en baanbrekende mikroskopietegniek genaamd SCLIM te gebruik, het ons die nuut gesintetiseerde Gas1-GFP ('n belangrike plasmamembraan GPI-AP met 'n baie lang asielketting (C26) seramiedlipiedgedeelte) in gis gedemonstreer. Die streke wat in diskrete ER's gegroepeer is, word geassosieer met spesifieke ERES, terwyl transmembraan-gesekreteerde proteïene deur die ER-membraan versprei is (Figuur 1). Daarbenewens betree hierdie twee tipes goedere verskillende ERES selektief (Figuur 2). Die asielkettinglengte van die sellulêre seramied in die membraan word verminder van C26 na C18-C16, die Gas1-GFP-groep word ontwrig in die diskrete ER-streek, en Gas1-GFP word herlei om die ER met die transmembraanproteïen deur dieselfde ERES te verlaat (Figuur 3 en Figuur 3).4).
Alhoewel GPI-AP 'n gespesialiseerde proteïenmeganisme gebruik om ER te verlaat, het ons gevind dat C26-seramied-afhanklike skeiding nie staatmaak op differensiële proteïeninteraksies wat tot ERES-spesialisasie kan lei nie (Figure S4 en S5). In plaas daarvan ondersteun ons bevindinge 'n alternatiewe klassifikasiemeganisme wat gedryf word deur lipied-gebaseerde proteïengroepering en daaropvolgende uitsluiting van ander ladings. Ons waarnemings dui daarop dat die Gas1-GFP-streek of -groep wat met 'n spesifieke ERES geassosieer word, die transmembraan-afskeide proteïen Mid2-iRFP kortkom, wat aandui dat die C26-seramied-afhanklike GPI-AP-groep hul toetrede tot die relevante ERES sal vergemaklik, en terselfdertyd transmembraan sal uitsluit. Die afskeidings gaan hierdie spesifieke ERES binne (Figure 1 en 2). In teenstelling hiermee veroorsaak die teenwoordigheid van C18-C16-seramiede in die ER-membraan nie dat GPI-AP streke of groepe vorm nie, dus sluit hulle nie transmembraan-afskeide proteïene in dieselfde ERES uit of vervang dit nie (Figure 3 en 4). Daarom stel ons voor dat C26-seramied skeiding en klassifikasie dryf deur die groepering van proteïene gekoppel aan spesifieke ERES te fasiliteer.
Hoe om hierdie C26-seramied-afhanklike groepering in 'n spesifieke ER-area te bereik? Die neiging van membraan-seramied om lateraal te skei, kan veroorsaak dat GPI-AP en C26-seramied klein en oombliklik geordende lipiede vorm in die meer onreëlmatige lipiedomgewing van die ER-membraan wat korter en onversadigde gliserolipiede bevat. Kwaliteitsgroepe (17, 18). Hierdie klein tydelike groepe kan verder saamgesmelt word in groter, meer stabiele groepe na binding aan die p24-kompleks (34). In ooreenstemming hiermee het ons getoon dat C26 Gas1-GFP met die p24-kompleks moet interaksie hê om groter sigbare groepe te vorm (Figuur 3). Die p24-kompleks is 'n heterosigotiese oligomeer wat saamgestel is uit vier verskillende p24-transmembraanproteïene in gis (35), wat multivalente binding bied, wat kan lei tot kruisbinding van klein GPI-AP-groepe, waardeur groter stabiele groepe (34) gegenereer word. Die interaksie tussen die proteïen-ektodomeine van GPI-AP's kan ook bydra tot hul aggregasie, soos getoon tydens hul Golgi-transport in soogdiergepolariseerde epiteelselle (36). Wanneer C18-C16 seramied egter in die ER-membraan teenwoordig is, sal groot aparte trosse nie gevorm word wanneer die p24-kompleks aan Gas1-GFP bind nie. Die onderliggende meganisme kan afhang van die spesifieke fisiese en chemiese eienskappe van die lang asielketting-seramied. Biofisiese studies van kunsmatige membrane toon dat hoewel beide lang (C24) en kort (C18-C16) asielketting-seramiede faseskeiding kan veroorsaak, slegs lang asielketting-seramiede (C24) hoë kromming en filmbuiging kan bevorder om die film te hervorm. Deur wedersydse verwysing (17, 37, 38). Daar is aangetoon dat die transmembraanheliks van TMED2, die menslike homoloog van Emp24, selektief interaksie het met C18 seramied-gebaseerde sfingomielien in die sitoplasmiese lobule (39). Deur molekulêre dinamika (MD) simulasies te gebruik, het ons gevind dat beide C18 en C26 seramiede rondom die sitoplasmiese lobule van die Emp24 transmembraanheliks ophoop, en hulle het soortgelyke voorkeure (Figuur S6). Dit is opmerklik dat dit aandui dat die transmembraanheliks van Emp24 kan lei tot asimmetriese verspreiding van lipiede in die membraan. Dit is 'n onlangse resultaat gebaseer op soogdierselle. Soortgelyke MD simulasies toon ook die teenwoordigheid van eterlipiede (40). Daarom spekuleer ons dat C26 seramied in die twee lobule van ER26 plaaslik verryk is. Wanneer GPI-AP in die luminale lobule direk aan multivalente p24 bind en die ophoping van C26-seramied rondom p24 in die sitoplasmiese lobule, kan dit die gepaardgaande proteïenaggregasie bevorder en membraankromming word deur die vingers gegenereer (41), wat veroorsaak dat GPI-AP in afsonderlike streke langs ERES skei, wat ook die hoogs geboë streke van die ER-membraan bevoordeel (42). Vorige verslae het die voorgestelde meganisme ondersteun (43, 44). Die multivalente binding van oligolektiene, patogene of teenliggaampies aan seramied-gebaseerde glikosfingolipiede (GSL) op die plasmamembraan veroorsaak groot GSL-aggregasie, verbeter faseskeiding en veroorsaak membraanvervorming en internalisering (44). Iwabuchi ens. (43) Daar is gevind dat in die teenwoordigheid van lang (C24) maar nie kort (C16) asielkettings nie, die multivalente ligand wat aan GSL-laktosielseramied gebind is, die vorming van groot trosse en membraaninvaginasie veroorsaak het, en die sitoplasma Lyn-gemedieerde seintransduksie op die pamflette word deur asielkettings in gekoppelde neutrofiele verweef.
In soogdiergepolariseerde epiteelselle beheer die konsentrasie van die anti-Golgi-netwerk (TGN) tot die vlak van die apikale plasmamembraan die skeiding en sortering van GPI-AP (10, 45). Hierdie aggregasie word aangedryf deur GPI-AP-oligomerisasie (36), maar dit kan ook afhang van die seramiedkettinglengte wat ons in gis vind. Alhoewel soogdier-GPI-AP 'n eterlipied-gebaseerde anker het, en die chemiese struktuur daarvan baie verskil van die baie lang asielketting-seramied, het 'n onlangse studie bevind dat beide lipiede evolusionêr soortgelyke fisiese en chemiese eienskappe en funksie het (40). Daarom kan die eterlipieddeel in soogdierselle soortgelyk wees aan die C26-seramied in gis, en die rol daarvan is om met die langketting-seramied in die membraan te assosieer om GPI-AP-aggregasie en sortering te bevorder. Alhoewel hierdie moontlikheid nog direk getoets moet word, ondersteun vorige bevindinge dat die vervoer van die lang asielketting-seramied na die Golgi-liggaam nie deur sitoplasmiese oordragproteïene uitgevoer word nie, maar afhang van die sintese van GPI-ankers soos gis. Daarom blyk die evolusionêre konserwatiewe meganisme in staat te wees om selektief baie lang asielketting-seramied en GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) in dieselfde transportvesikel saam te vervoer.
In gis- en soogdiergepolariseerde epiteelselstelsels vind GPI-AP-aggregasie en skeiding van ander plasmamembraanproteïene alles plaas voordat dit die seloppervlak bereik. Paladino et al. (48) het bevind dat op die TGN van soogdiergepolariseerde epiteelselle, GPI-AP-groepering nie net nodig is vir die selektiewe klassifikasie van GPI-AP's na die apikale plasmamembraan nie, maar ook die groeperingsorganisasie van GPI-AP's en die biologiese aktiwiteit daarvan reguleer. Seloppervlak. In gis het hierdie studie getoon dat die C26-seramied-afhanklike GPI-AP-groepering op die ER die groeperingsorganisasie en funksionele aktiwiteit van GPI-AP op die plasmamembraan kan reguleer (24, 49). In ooreenstemming met hierdie model is GhLag1-selle allergies vir GPI-inhibeerders of middels wat die selwandintegriteit beïnvloed (28), en die behoefte aan funksionele Gas1-GFP-groeperings (49) van die punt-seramied wat in die paring van gisselle geprojekteer word, dui op moontlike fisiologiese gevolge van hLag1-selle. GPI-AP-fout. Verdere toetsing of die funksionele organisasie van die seloppervlak vanaf die ER geprogrammeer is deur 'n sorteermetode gebaseer op lipiedlengte, sal egter die onderwerp van ons toekomstige navorsing wees.
Die Saccharomyces cerevisiae-stamme wat in hierdie werk gebruik is, word in Tabel S1 gelys. Die MMY1583- en MMY1635-stamme van SCLIM vir lewende selbeelding is in die agtergrond van W303 gekonstrueer. Hierdie stamme wat Sec13-mCherry met 'n fluoreserende proteïenmerker uitdruk, is gekonstrueer met behulp van 'n polimerase-kettingreaksie (PCR)-gebaseerde metode met pFA6a-plasmied as 'n templaat (23). Die stam wat Mid2-iRFP uitdruk wat met fluoreserende proteïen gemerk is onder die beheer van die GAL1-promotor, is soos volg gekonstrueer. PCR-amplifikasie van iRFP-KanMx-volgorde vanaf pKTiRFP-KAN-vektor (geskenk van E. O'Shea, Addgene-plasmiednommer 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; navorsingshulpbronidentifiseerder (RRID): Addgene_64687) en in die C-terminus van endogene Mid2 ingevoeg. Nadat die Mid2-iRFP-genoomvolgorde geamplifiseer en in die GAL1-promotor gekloon is, is dit in die Not I-Sac I-plek van die integrasieplasmied pRS306 geïntegreer. Die gevolglike plasmied pRGS7 is met Pst I gelineariseer om in die URA3-lokus te integreer.
Die Gas1-GFP-fusiegeen word uitgedruk onder die beheer van die GAL1-promotor in die sentromeer (CEN) plasmied, wat soos volg gekonstrueer is. Die Gas1-GFP-volgorde is geamplifiseer deur PCR vanaf die pRS416-GAS1-GFP plasmied (24) (geskenk van L. Popolo) en gekloon in die Xma I-Xho I-plek van die CEN plasmied pBEVY-GL LEU2 (geskenk van C). Miller; Addgene plasmiednommer 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Die gevolglike plasmied is pRGS6 genoem. Die Axl2-GFP-fusiegeen word ook uitgedruk onder die beheer van die GAL1-promotor van die pBEVY-GL LEU2-vektor, en die konstruksie daarvan is soos volg. Die Axl2-GFP-volgorde is deur PCR vanaf pRS304-p2HSE-Axl2-GFP-plasmied (23) geamplifiseer en in die BamHI-PstI-plek van die pBEVY-GL LEU2-vektor gekloon. Die gevolglike plasmied is pRGS12 genoem. Die volgorde van die oligonukleotiede wat in hierdie studie gebruik is, word in Tabel S2 gelys.
Die stam is aangevul met 0.2% adenien en 2% glukose [YP-dekstrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose] ryk gisekstrak proteïen p (YP) medium (1% gisekstrak en 2% proteïen ept). (YPR)] of 2% galaktose [YP-galaktose (YPG)] as 'n koolstofbron, of in 'n sintetiese minimale medium (0.15% gis stikstofbasis en 0.5% ammoniumsulfaat) om toepaslike aminosure en basisse wat vir voeding benodig word, aan te vul, en wat 2% glukose (sintetiese glukose minimaal medium) of 2% galaktose (sintetiese galaktose minimaal medium) as 'n koolstofbron bevat.
Vir intydse beeldvorming is temperatuursensitiewe sec31-1-mutantselle wat die konstruk onder die GAL1-promotor uitdruk, oornag tot mid-logaritmiese fase in YPR-medium by 24°C gekweek. Na induksie in YPG by 24°C vir 1 uur, is die selle vir 30 minute in SG by 37°C geïnkubeer en toe na 24°C oorgedra om van die afskeidingsblok vry te stel. Konkanavalien A is gebruik om die selle op 'n glasplaatjie te fikseer en deur SCLIM afgebeeld. SCLIM is 'n kombinasie van die Olympus IX-71 omgekeerde fluoresensiemikroskoop en die UPlanSApo 100×1.4 numeriese diafragma-olielens (Olympus), 'n hoëspoed- en hoë-sein-tot-ruisverhouding roterende skyfkonfokale skandeerder (Yokogawa Electric), 'n pasgemaakte spektrometer en pasgemaakte verkoeling. Die stelsel se beeldversterker (Hamamatsu Photonics) kan 'n vergrootglaslensstelsel met 'n finale vergroting van ×266.7 en 'n ladinggekoppelde toestelkamera wat elektrone vermenigvuldig (Hamamatsu Photonics) (21) verskaf. Beeldverkryging word uitgevoer deur pasgemaakte sagteware (Yokogawa Electric). Vir 3D-beelde het ons 'n pasgemaakte piezo-elektriese aktuator gebruik om die objektieflens vertikaal te vibreer, en die optiese dele 100 nm uitmekaar in 'n stapel versamel. Die Z-stapelbeeld word omgeskakel na 3D-voxeldata, en die teoretiese puntverspreidingsfunksie wat vir die roterende skyfkonfokale mikroskoop gebruik word, word gebruik vir dekonvolusieverwerking deur Volocity-sagteware (PerkinElmer). Deur Volocity-sagteware te gebruik om outomaties drempelwaardes vir ko-lokasie-analise te bepaal, is ERES, insluitend vrag, gemeet. Lynskandering-analise is uitgevoer met behulp van MetaMorph-sagteware (Molecular Devices).
Gebruik GraphPad Prism sagteware om statistiese betekenisvolheid te bepaal. Vir die tweesydige Student se t-toets en die gewone eenrigting-variansie-analise (ANOVA) toets word verskille tussen groepe as beduidend beskou op P <0.05 (*).
Vir fluoresensiemikroskopie van Gas1-GFP is die logfase-selle oornag in YPD gekweek en deur sentrifugering versamel, twee keer met fosfaatgebufferde soutoplossing gewas en vir ten minste 15 minute op ys geïnkubeer, en toe onder die mikroskoop voortgegaan soos voorheen beskryf in Kontrole (24). Die Leica DMi8-mikroskoop (HCX PL APO 1003/1.40 olie PH3 CS) toegerus met 'n objektieflens, L5 (GFP) filter, Hamamatsu-kamera en Application Suite X (LAS X) sagteware is vir verkryging gebruik.
Die monsters is gedenatureer met SDS-monsterbuffer by 65°C vir 10 minute, en toe geskei deur SDS-poliakrielamiedgelelektroforese (PAGE). Vir immunoblotting-analise is 10 μl monster per baan gelaai. Primêre teenliggaam: Gebruik konyn poliklonale anti-Gas1 teen 'n verdunning van 1:3000, konyn poliklonale anti-Emp24 teen 'n verdunning van 1:500, en konyn poliklonale anti-GFP (’n geskenk van H. Riezman) teen 'n verdunning van 1:3000. Die muis monoklonale anti-Pgk1-teenliggaam is gebruik teen 'n verdunning van 1:5000 (’n geskenk van J. de la Cruz). Sekondêre teenliggaam: Mierikswortelperoksidase (HRP) gekonjugeerde bok-anti-konyn immunoglobulien G (IgG) gebruik teen 'n verdunning van 1:3000 (Pierce). HRP-gekonjugeerde bok-anti-muis IgG is gebruik teen 'n verdunning van 1:3000 (Pierce). Die immuunresponssone is waargeneem deur die chemiluminessensie-metode van SuperSignal West Pico-reagens (Thermo Fisher Scientific).
Soos beskryf in (31), is 'n natuurlike immunopresipitasie-eksperiment op die verrykte ER-fraksie uitgevoer. Kortliks, was gisselle twee keer met TNE-buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenielmetielsulfonielfluoried en protease-inhibeerdermengsel) by 600 nm (OD600) by 100 optiese digtheid. Dit is met glaskrale gebreek, en dan is die selpeste en glaskrale deur sentrifugering verwyder. Die supernatant is dan vir 15 minute by 4°C by 17 000 g gesentrifugeer. Die pellet is in TNE hersuspendeer en digitalis-saponien is bygevoeg tot 'n finale konsentrasie van 1%. Die suspensie is vir 1 uur met rotasie by 4°C geïnkubeer, en dan is die onoplosbare komponente deur sentrifugering by 13 000 g by 4°C vir 60 minute verwyder. Vir Gas1-GFP-immunopresipitasie, inkubeer eers die monster met leë agarosekrale (ChromoTek) by 4°C vir 1 uur, en inkubeer dan met GFP-Trap_A (ChromoTek) by 4°C vir 3 uur. Die immunopresipiteerde krale is vyf keer gewas met TNE wat 0.2% digoksigenien bevat, geëlueer met SDS-monsterbuffer, geskei op SDS-PAGE, en geanaliseer deur immunoblotting.
Soos beskryf in (31), is kruisbindingsbepaling op die verrykte ER-fraksie uitgevoer. Kortliks, die verrykte ER-fraksie is geïnkubeer met 0.5 mM ditiobis(suksinimidielpropionaat) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, VSA; 20°C, 20 min). Die kruisbindingsreaksie is geblus deur glisien by te voeg (50 mM finale konsentrasie, 5 minute, 20°C).
Soos voorheen beskryf (50), is MS-analise van seramied in wildetipe- en GhLag1-stamme uitgevoer. Kortliks, selle is tot eksponensiële fase (3 tot 4 OD600-eenhede/ml) in YPD by 30°C gekweek, en 25×107 selle is geoes. Hul metabolisme word geblus met trichloorasynsuur. Gebruik ekstraksie-oplosmiddel [etanol, water, eter, piridien en 4.2 N ammoniumhidroksied (15:15:5:1:0.018 v/v)] en 1.2 nmol interne standaard C17 seramied (860517, Avanti polêre lipied) kwaliteit). Gebruik monometielamienreagens [metanol, water, n-butanol en metielamienoplossing (4:3:1:5 v/v)] om ligte alkaliese hidrolise van die ekstrak uit te voer, en gebruik dan waterversadigde n-butanol om te ontsout. Laastens is die ekstrak in 'n positiewe modus oplosmiddel [chloroform/metanol/water (2:7:1) + 5 mM ammoniumasetaat] hersuspendeer en in die massaspektrometer ingespuit. Multireaksiemonitering (MRM) is uitgevoer vir die identifisering en kwantifisering van sfingolipiedmolekules. Die TSQ Vantage tersiêre kwadrupoolmassaspektrometer (Thermo Fisher Scientific) is toegerus met 'n robotiese nanovloei-ioonbron Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) vir lipiedanalise. Die botsingsenergie is vir elke seramiedkategorie geoptimaliseer. MS-data is in positiewe modus verkry. Vir elke biologiese replikaat is die lipiedsein die mediaan van drie onafhanklike metings.
Soos beskryf in (31), is die selle (800×107) wat Gas1-GFP uitdruk, aan natuurlike immunopresipitasie onderwerp. Die gesuiwerde Gas1-GFP is deur SDS-PAGE geskei en na 'n polivinilideenfluoried (PVDF) membraan oorgedra. Die proteïen is gevisualiseer deur PVDF met amiedswart te kleur. Die Gas1-GFP-band is van die PVDF afgesny en 5 keer met metanol en een keer met vloeistofchromatografie-MS (LC-MS) graad water gewas. Deur die membraanstrook met 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), buffer en 500μl vars opgeloste 1 M natriumnitrietmengsel by 37°C vir 3 uur te inkubeer, word die lipiedfraksie van Gas1-GFP vrygestel en geliseer. Vrystelling van inosienfosfaat-seramied tussen glukosamien en inositol (51). Daarna is die membraanstrook vier keer met LC-MS graad water gewas, by kamertemperatuur gedroog en in 'n stikstofatmosfeer by -80°C gestoor tot analise. As 'n kontrole is 'n blanko monster van PVDF-membraan vir elke eksperiment gebruik. Die lipied wat uit Gas1-GFP onttrek is, is toe deur MS geanaliseer soos beskryf (50). Kortliks, PVDF-stroke wat GPI-lipied bevat, is hersuspendeer in 75 μl negatiewe vormoplosmiddel [chloroform/metanol (1:2) + 5 mM ammoniumasetaat] en het elektrosproei-ionisasie (ESI)-MRM/MS-analise van sfingolipiedspesies (TSQ Vantage) geslaag. In hierdie geval is MS-data in negatiewe ioonmodus verkry.
Soos vroeër genoem, is die lipiedgedeelte van die GPI-anker geskei van die [3H]-inositol-gemerkte GPI-AP (16). Die lipiede is geskei deur dunlaagchromatografie met behulp van 'n oplosmiddelstelsel (55:45:10 chloroform-metanol-0.25% KCl) en gevisualiseer met behulp van FLA-7000 (Fujifilm).
Die selle wat Gas1-GFP (600×107) uitdruk, is twee keer met TNE-buffer gewas, met glaskrale gebreek en toe gesentrifugeer om selpeste en glaskrale te verwyder. Die supernatant is toe vir 1 uur by 4°C by 17 000 g gesentrifugeer. Die pellet is in TNE gewas en vir 1 uur by 37°C met 1 U PI-PLC (Invitrogen) in TNE wat 0,2% digitalis-saponien bevat, geïnkubeer. Na die ensiembehandeling is die membraan vir 1 uur deur sentrifugering by 4°C by 17 000 g verwyder. Om Gas1-GFP te immunopresipiteer, is die supernatant oornag met GFP-Trap_A (ChromoTek) by 4°C geïnkubeer. Die gesuiwerde Gas1-GFP, geskei deur SDS-PAGE, is met Coomassie briljantblou gekleur. Die Gas1-GFP-kleurband is afgesny van die grys rondom die akwaduk, en na alkilering met jodoasetamied en reduksie met ditiotreitol, is in-gel-vertering met tripsien uitgevoer. Ekstraheer en droog triptiese peptiede en peptiede met GPI-glikane. Die gedroogde peptied is in 20 μl water opgelos. Spuit 'n gedeelte (8μl) in die LC in. 'n Oktadekielsilaan (ODS)-kolom (Develosil 300ODS-HG-5; binnediameter 150 mm × 1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefektuur, Japan) is gebruik om peptiede onder spesifieke gradiënttoestande te skei. Die mobiele fase is oplosmiddel A (0.08% miersuur) en oplosmiddel B (0.15% miersuur in 80% asetonitriel). 'n Accela HPLC-stelsel (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) is gebruik om die kolom met oplosmiddel A binne 55 minute teen 'n vloeitempo van 50 μl min-1 vir 5 minute te elueer, en toe is die konsentrasie van oplosmiddel B verhoog tot 40%. (Verenigde State). Die eluaat is voortdurend in die ESI-ioonbron ingebring, en die triptiese peptiede en peptiede met GPI-glikane is geanaliseer deur LTQ Orbitrap XL (hibriede lineêre ioonval-orbitrap massaspektrometer; Thermo Fisher Scientific). In die MS-opstelling is die spanning van die kapillêre bron op 4.5 kV gestel, en die temperatuur van die oordragkapillêr is op 300°C gehou. Die kapillêre spanning en buislensspanning is onderskeidelik op 15 V en 50 V gestel. MS-data is verkry in die positiewe ioonmodus (resolusie van 60 000; massa-akkuraatheid van 10 dele per miljoen) in 'n massa-reeks van 300/m/z massa/ladingverhouding (m/z) 3000. Die MS/MS-data word verkry deur die ioonval in die LTQ Orbitrap XL [die eerste 3 syfers waarvan die data afhanklik is, botsing-geïnduseerde dissosiasie (CID)].
MD-simulasies is uitgevoer met behulp van GROMACS (52) sagteware en MARTINI 2 kragveld (53-55). Die CHARMM GUI Membraanbouer (56, 57) is toe gebruik om 'n dubbellaag te konstrueer wat dioleoïelfosfatidielcholien (DOPC) en Cer C18 of DOPC en Cer C26 bevat. Die topologie en koördinate van Cer C26 word afgelei van DXCE deur die ekstra krale van die sfingosienstert te verwyder. Gebruik die proses wat hieronder beskryf word om die dubbellaag te balanseer en dit te laat loop, gebruik dan die laaste koördinate van die stelsel om 'n stelsel te bou wat Emp24 bevat. Die transmembraandomein van gis Emp24 (residue 173 tot 193) is as 'n α-heliks gekonstrueer met behulp van die visuele MD (VMD) instrument molekulêre struktuur (58). Daarna, na die verwydering van die oorvleuelende lipiede, is die proteïen grof gegranuleer en in die dubbellaag ingevoeg met behulp van CHARMM GUI. Die finale stelsel bevat 1202 DOPC en 302 Cer C26 of 1197 DOPC en 295 Cer C18 en Emp24. Ioniseer die stelsel tot 'n konsentrasie van 0.150M. Vier onafhanklike replikate is gemaak vir twee dubbellaag-samestellings.
Die lipied-dubbellaag word gebalanseer met behulp van die CHARMM GUI-proses, wat die minimalisering en dan balansering van 405 000 stappe behels, waar die posisiebeperkings geleidelik verminder en uitgeskakel word, en die tydstap verhoog word van 0,005 ps tot 0,02 ps. Na ekwilibrasie produseer dit 6 µs met 'n tydstap van 0,02 ps. Nadat Emp24 ingevoeg is, gebruik dieselfde CHARMM GUI-proses om die stelsel te minimaliseer en te balanseer, en laat dit dan vir 8 s in produksie loop.
Vir alle stelsels word die druk tydens die balanseringsproses beheer deur die Berendsen-barostaat (59), en tydens die produksieproses word die druk beheer deur die Parrinello-Rahman-barostaat (60). In alle gevalle is die gemiddelde druk 1 bar en word 'n semi-isotropiese drukkoppelingskema gebruik. In die balanserings- en produksieproses word 'n termostaat (61) met spoedherkalibrasie gebruik om die temperatuur van proteïen-, lipied- en oplosmiddeldeeltjies onderskeidelik te koppel. Gedurende die hele operasie is die teikentemperatuur 310K. Die nie-bindingsinteraksie word bereken deur 'n paringslys te genereer met behulp van die Verlet-skema met 0.005 buffertoleransie. Die Coulomb-term word bereken met behulp van die reaksieveld en 'n afsnyafstand van 1.1 nm. Die Vander Waals-term gebruik 'n afsnyskema met 'n afsnyafstand van 1.1 nm, en die Verlet-afsnyskema word gebruik vir potensiële drywing (62).
Deur gebruik te maak van VMD, is die afsnygolflengte tussen DOPC-fosfaatkrale of seramied AM1-krale en die proteïen 0.7 nm, en die aantal lipiede wat met die proteïen interaksie het, word bereken. Bereken die uitputting-verrykingsfaktor (DE) volgens die volgende formule soos in (63): DE-faktor = (die hoeveelheid totale lipiede in die proteïen 0.7) in die proteïen 0.7 (die hoeveelheid Cer in totale lipiede)
Die gerapporteerde waarde word as 'n gemiddelde verkry, en die foutbalke is vier onafhanklike kopieë van SE. Die statistiese betekenisvolheid van die DE-faktor word bereken deur die t-toets [(gemiddeldeDE-faktor-1)/SE]. Bereken die P-waarde vanaf die eensydige verspreiding.
Die GROMACS-instrument is gebruik om die 2D laterale digtheidskaart van die stelsel wat Emp24 bevat binne die laaste 250 ns van die spoor te bereken. Om die verrykings-/uitputtingskaart van seramied te verkry, word die digtheidskaart van Cer gedeel deur die som van die kaart van Cer en DOPC, en dan gedeel deur die konsentrasie van Cer in die liggaam. Dieselfde kleurkaartskaal word gebruik.
Vir aanvullende materiaal vir hierdie artikel, sien asseblief http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Hierdie is 'n ooptoegangartikel wat versprei word onder die bepalings van die Creative Commons Attribution-Nie-Kommersiële Lisensie, wat die gebruik, verspreiding en reproduksie in enige medium toelaat, solank die finale gebruik nie vir kommersiële gewin is nie en die uitgangspunt is dat die oorspronklike werk korrek is. Verwysing.
Let wel: Ons vra jou slegs om jou e-posadres te verskaf sodat die persoon wat jy aanbeveel vir die bladsy weet dat jy wil hê hulle moet die e-pos sien en dat dit nie strooipos is nie. Ons sal geen e-posadresse vasvang nie.
Hierdie vraag word gebruik om te toets of jy 'n besoeker is en om outomatiese strooipos-indiening te voorkom.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Sergio -Linero, Wagho Sergio Linero, Wagho (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D hoë-resolusie intydse beeldvorming onthul die belangrikheid van seramiedkettinglengte vir proteïensortering in selektiewe uitvoerplekke.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Sergio -Linero, Wagho Sergio Linero, Wagho (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D hoë-resolusie intydse beeldvorming onthul die belangrikheid van seramiedkettinglengte vir proteïensortering in selektiewe uitvoerplekke.
©2020 American Association for the Advancement of Science. alle regte voorbehou. AAAS is 'n vennoot van HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.