Dankie dat u Nature.com besoek het. Die blaaierweergawe wat u gebruik, het beperkte ondersteuning vir CSS. Vir die beste ervaring beveel ons aan dat u 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer afskakel). Intussen, om voortgesette ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript vertoon.
Anders as gewerweldes, word daar algemeen geglo dat insekte nie manlik-bevooroordeelde geslagsteroïedhormone het nie. In Anopheles gambiae blyk dit dat die ekdisoonsteroïed 20-hidroksiekdisoon (20E) ontwikkel het om eierontwikkeling te beheer wanneer dit deur wyfies gesintetiseer word2 en om 'n paringsvryvaste periode te veroorsaak wanneer dit seksueel deur mannetjies oorgedra word3. Aangesien eierontwikkeling en paring noodsaaklike voortplantingseienskappe is, kan die begrip van hoe vroulike Anopheles-muskiete hierdie hormonale seine integreer, die ontwerp van nuwe malariabeheerprogramme vergemaklik. Hier onthul ons dat hierdie voortplantingsfunksies deur verskillende geslagsteroïede gereguleer word deur 'n komplekse netwerk van ekdisteroïed-aktiverende/inaktiverende ensieme. Ons het 'n manlik-spesifieke geoksideerde ekdisoon, 3-dehidro-20E (3D20E), geïdentifiseer wat ouerskap beskerm deur vroulike seksuele ontvanklikheid na seksuele oordrag en aktivering deur defosforilering af te sluit. Dit is opmerklik dat 3D20E-oordrag ook die uitdrukking van voortplantingsgene veroorsaak het wat eierontwikkeling tydens Plasmodium-infeksie handhaaf, wat die gesondheid van besmette wyfies verseker. Vroulik-afgeleide 20E ontlok nie 'n seksuele reaksie nie, maar laat parende individue toe om eiers te lê nadat 20E-inhiberende kinases geïnhibeer is. Die identifisering van hierdie manlik-spesifieke inseksteroïedhormoon en sy rol in die regulering van vroulike seksuele ontvanklikheid, vrugbaarheid en interaksie met Plasmodium dui op die potensiaal om die reproduktiewe sukses van malaria-oordragende muskiete te verminder.
Malariagevalle en sterftes neem weer toe4 as gevolg van wydverspreide insekdoderweerstand in Anopheles-muskiete, die enigste vektor van menslike malariaparasiete. Die paringsbiologie van hierdie muskiete is 'n besonder aantreklike teiken vir nuwe malariabeheer-intervensies omdat wyfies slegs een keer paar5; om hierdie enkele paringsgebeurtenis steriel te maak, sou groot potensiaal hê om muskietbevolkings in die veld te verminder.
Vroue raak seksueel onbekwaam nadat hulle hoë-titer steroïedhormone van mans ontvang het. Studies het getoon dat die oorsaak van probleme met verdere paring 20-hidroksiekdisoon (20E) is, 'n steroïedhormoon beter bekend as 'n reguleerder van die vervellingsiklus in die larwale stadium. Die vermoë van mannetjies om 20E te sintetiseer en oor te dra, het spesifiek ontwikkel in Anopheles-spesies wat deel is van die subgenus Cellia7, wat in Afrika versprei is en die gevaarlikste vektore van malaria insluit, insluitend Anopheles gambiae. Dit is veral noemenswaardig omdat wyfies in hierdie spesies ook 20E na elke bloedmaaltyd produseer, en 20E die oogenese-siklus dryf (sien verw. 8). Min is egter bekend oor die manier waarop wyfies seine van twee verskillende bronne van ekdisoon (manlike oordrag en bloedvoedingsinduksie) integreer sonder om hul eie vermoë om te paar in die gedrang te bring. Trouens, as die 20E wat deur die wyfies geproduseer word, seksuele onverdraagsaamheid veroorsaak, sal dit lei tot onvrugbaarheid in maagdelik voedende individue, 'n baie algemene gedrag in hierdie muskiete5.
'n Moontlike verduideliking is dat A. gambiae-mannetjies 'n gemodifiseerde mannetjie-spesifieke ekdisoon oordra, wat 'n seinkaskade in die vroulike voortplantingskanaal aktiveer, wat lei tot paringsonstabiliteit. Alhoewel gewerweldes verskeie steroïedhormone het, soos estrogeen en androgeen (hersien in verwysing 9), is androgeen-bevooroordeelde steroïede sover ons weet nog nie in insekte geïdentifiseer nie.
Ons het die repertoire van steroïedhormone in die manlike bykomende klier (MAG) van seksueel volwasse A. gambiae bepaal op soek na moontlike modifiserende steroïede. Deur gebruik te maak van hoëprestasievloeistofchromatografie gekoppel aan tandemmassaspektrometrie (HPLC-MS/MS) eerder as die minder spesifieke metode wat voorheen gebruik is, het ons ekdisoon (E) en 20E in hierdie weefsel opgespoor, wat die vorige resultaat bevestig. Die monster is egter oorheers deur geoksideerde gefosforileerde steroïede, wat ooreenstem met die formule 3-dehidro-20E-22-fosfaat (3D20E22P)12 (Figuur 1). Ander vorme sluit in 3-dehidro-20E (3D20E) en 20E-22-fosfaat (20E22P). Die HPLC-MS/MS seinintensiteit van 3D20E22P was twee ordes van grootte hoër as sy gedefosforileerde vorm, 3D20E, en drie ordes van grootte hoër as dié van E en 20E (Figuur 1). Alhoewel dit in ander dele van die liggaam en die ... onderste voortplantingskanaal (LRT; Uitgebreide Data Fig. 1a). Ons het ook ekdisteroïede in nuut geslote (<1 dag oud) mannetjies en wyfies geanaliseer en slegs 3D20E en 3D20E22P in MAG opgespoor; E, 20E en 20E22P was in beide geslagte teenwoordig (Uitgebreide Data Fig. 1b). Hierdie data dui daarop dat volwasse mannetjies van A. gambiae hoë titers van modifiserende hormone in hul MAG's produseer wat nie deur wyfies gesintetiseer word nie.
MAG en vroulike LRT (insluitend atria, seminale vesikels en parovarium) is gedissekteer van 4 dae oue (4 dae oue) maagdelike mans en maagdelike en gepaarde wyfies (0.5, 3 en 12 hpm). Ecdysone in hierdie weefsels is geanaliseer deur HPLC-MS/MS (gemiddeld ± sem; ongepaarde t-toets, tweesydig, vals ontdekkingskoers (FDR) gekorrigeer; NS, nie beduidend nie; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 uur vs. 0.5 uur, P = 0.035; 12 uur vs. 3 uur, P = 0.0015; 12 uur vs. 0.5 uur, P = 0.030. 3D20E22P: 3 uur vs. 0.5 uur, P = 0.25; 12 uur vs. 3 uur, P = 0.0032; 12 uur teenoor 0.5 uur, P = 0.015). Data is van drie biologiese replikate. Die piekarea vir elke ekdisoon van belang is bereken en genormaliseer deur die aantal muskiete. Ekdisoon word soos volg deur kleur voorgestel: E, groen; 20E, oranje; 20E22P, pers; 3D20E, blou; 3D20E22P, pienk. Die insetsel vergroot die skaal op die y-as om laer ekdisoonvlakke te toon.
Om te ondersoek of 3D20E22P en 3D20E tydens paring oorgedra word, het ons vroulike LRT's op verskeie tydspunte na paring gedissekteer. Alhoewel ekdisoon nie in maagde gevind is nie, het ons aansienlike hoeveelhede 3D20E22P in die LRT onmiddellik na paring waargeneem (0.5 uur na paring, hpm), wat mettertyd afgeneem het, terwyl 3D20E-vlakke beduidend toegeneem het (Fig. 1). Deur chemies gesintetiseerde 3D20E as 'n standaard te gebruik, het ons bepaal dat vlakke van hierdie steroïedhormoon in parings-LRT's ten minste 100 keer hoër was as 20E (Uitgebreide Datatabel 1). Dus is 3D20E22P die belangrikste manlike ekdisoon wat tydens paring na die vroulike LRT oorgedra word, en die gedefosforileerde vorm daarvan, 3D20E, word kort na paring baie volop. Dit dui op 'n belangrike rol vir laasgenoemde ekdisoon in vroulike biologie na paring.
Nadat ons 'n nuwe RNS-volgordebepaling (RNS-volgordebepaling) datastel (Fig. 2a) gegenereer het, met behulp van 'n pasgemaakte bioinformatika-pyplyn, het ons gesoek na ekdisoonkinase (EcK), ekdisoonoksidase (EO) en ekdisoon wat kodeer vir die 20E-gemodifiseerde fosfatase-geen. (EPP) word in voortplantingsweefsels uitgedruk. Ons het een kandidaat-EPP-geen en twee potensiële EcK-gene (EcK1 en EcK2) geïdentifiseer, maar kon nie 'n goeie kandidaat-EO-geen vind nie. Dit is opmerklik dat individuele EPP-gene op hoë vlakke (98.9ste persentiel) in Gambiese MAG's uitgedruk is, maar nie in vroulike LRT's nie (Fig. 2b), in teenstelling met ons verwagtinge aangesien defosforilering van 3D20E22P in hierdie vroulike weefsel plaasgevind het. Daarom glo ons dat manlike EPP tydens paring oorgedra kan word. Ons het inderdaad in vivo stabiele isotoop-etikettering gebruik om die vroulike proteïen na paring te masker, 'n ensiem wat deur MS in die vroulike atrium geïdentifiseer word (Fig. 2c en Aanvullende Tabel 1). Die teenwoordigheid van EPP in MAG en gepaarde (maar nie maagdelike) vroulike LRT is ook bevestig met behulp van spesifieke teenliggaampies (Fig. 2d).
a, 'n Pasgemaakte bioinformatika-pyplyn om die voortplantingsweefsels van elke geslag te deursoek vir gene wat kodeer vir EcK's, EO's en EPP's. Die getalle langs die pyle dui die aantal manlike en vroulike kandidate by elke stap aan. Hierdie analise het een EPP-geen (EPP) en een EcK-geen (EcK1) geïdentifiseer wat in mans uitgedruk word, en een EcK-geen (EcK2) wat in beide geslagte uitgedruk word, maar nie 'n kandidaat-EO-geen oplewer nie. b, Hittekaart wat kandidaat-geenuitdrukking in maagdelike (V) en parings- (M) Anopheles gambiae- en Anopheles albicans-weefsels vergelyk. Spca, bevrugting; MAG's, bykomende kliere in mans; ander dele van die liggaam, insluitend borste, vlerke, bene, vetliggame en interne organe in beide geslagte, en eierstokke in wyfies. EcK2 word hoogs uitgedruk in beide MAG en atria van Gambië, terwyl EPP slegs in MAG gevind word. c, Proteomiese analise van manlike ejakulaatgroep-translokasie na vroulike atria op 3, 12 en 24 hpm, wat die 67 volopste proteïene toon. Wyfies is grootgemaak op 'n dieet wat 15N bevat om alle proteïene te merk (en te masker). Ongemerkte mannetjies is gepaar met gemerkte wyfies, en vroulike LRT's is gedissekteer op 3, 12 en 24 hpm vir proteomiese analise (sien Aanvullende Tabel 1 vir 'n volledige lys van ejakulatoriese proteïene). Inset, EPP, Eck1 en EcK2 is in die MAG van maagdelike mannetjies opgespoor deur proteomiese analise van hierdie weefsels. d, EPP is opgespoor deur western blot in MAG en LRT van gepaarde wyfies, maar nie in maagdelike wyfies of mannetjies of die res van die vroulike liggaam nie. Membrane is gelyktydig gepeuter met anti-aktien (laaibeheer) en anti-EPP-teenliggaampies. Alle mans is maagde. Sien Aanvullende Figuur 1 vir gelbrondata. Westerse blots is twee keer uitgevoer met soortgelyke resultate.
Die ekdisteroïedfosfofosfatase-aktiwiteit van EPP is geverifieer na inkubasie deur HPLC-MS/MS met 3D20E22P geïsoleer van MAG (Uitgebreide Data Fig. 2a). Verder, toe ons EPP stilgemaak het deur RNA-gemedieerde interferensie (RNAi), het ons 'n sterk vermindering in fosfatase-aktiwiteit in die voortplantingsweefsels van hierdie mannetjies waargeneem (Fig. 3a), en wyfies wat gepaar is met EPP-stilgemaakte mannetjies het beduidende 'n laer proporsie van gedefosforileerde 3D20E getoon (Fig. 3b) ten spyte van gedeeltelike geenstilmaak (Uitgebreide Data Fig. 2b,c). In teenstelling hiermee het ons nie beduidende veranderinge in die 20E22P/20E-verhouding in dieselfde muskiete waargeneem nie, wat kan daarop dui dat die ensiem spesifiek is vir 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Verminderde fosfatase-aktiwiteit in MAG veroorsaak deur EPP-stilmaak met behulp van dubbelstrengige EPP RNA (dsEPP) of dubbelstrengige GFP RNA (dsGFP) kontroles. Twintig MAG-poele is in elke replikaat gebruik (P = 0.0046, gepaarde t-toets, tweesydig), verteenwoordig deur aparte kolletjies. b, Wyfies wat met EPP-stilgemaakte mannetjies gepaar is, het 'n beduidend laer proporsie gedefosforileerde 3D20E teen 3 hpm gehad (P = 0.0043, ongepaarde t-toets, tweesydig), terwyl 20E-vlakke onaangeraak was (P = 0.063, ongepaar). t-toets, tweesydig).Data word aangebied as gemiddelde ± sem van drie groepe van 13, 16 en 19 wyfies elk.c, Wyfies wat met EPP-stilgemaakte mannetjies gepaar is, het beduidend hoër herparingskoerse gehad (P = 0.0002, Fisher se presiese toets, tweesydig).Wyfies is eers gedwing om te paar om hul paringsstatus te verseker; 2 dae later is hulle in kontak gebring met ander mannetjies wat transgeniese sperm dra om herparingsyfers te bepaal deur kwantitatiewe PCR-opsporing van die transgeen.d, Bloedgevoerde wyfies wat met EPP-stilgemaakte mannetjies gepaar is, het beduidend verminderde vrugbaarheid (P < 0.0001; Mann-Whitney-toets, tweesydig) en effens verminderde eiergetal (P = 0.088, Mann-Whitney-toets, tweesydig) gehad, terwyl die paaikoers nie beïnvloed is nie (P = 0.94, Fisher se presiese toets, tweesydig). In alle panele verteenwoordig n die aantal biologies onafhanklike muskietmonsters.NS, nie beduidend nie.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Vervolgens het ons bepaal of ekdisoon-defosforilering belangrik is vir die induksie van paringsweerstand by wyfies. Dit is opmerklik dat wyfies wat met EPP-uitgeputte mannetjies gepaar is, met 'n baie hoër frekwensie (44.9%) herpaar het as kontrolewyfies (10.4%) toe hulle aan addisionele (transgeniese) mannetjies blootgestel is (Fig. 3c). Ons het ook 'n beduidende afname in vrugbaarheid waargeneem (Fig. 3d, links) en 'n effense afname in die aantal eiers wat deur hierdie wyfies gelê is (Fig. 3d, middel), terwyl die persentasie eiers wat deur wyfies gelê is (nog 'n reaksie wat deur paring by wyfies ontlok is) nie beïnvloed is nie (Fig. 3d, regs). Gegewe die waargenome spesifisiteit van EPP vir 3D20E22P, dui hierdie resultate daarop dat die aktivering van 3D20E deur EPP wat tydens paring oorgedra word, 'n belangrike rol kan speel in die afskakeling van vroulike ontvanklikheid vir verdere paring, 'n gedrag wat voorheen toegeskryf is aan die seksuele oordrag van 20E. Daarom beïnvloed hierdie manlik-spesifieke hormoon ook vroulike vrugbaarheid sterk.
Vervolgens het ons die aktiwiteite van 20E en 3D20E in inspuitingseksperimente in seksueel volwasse maagde vergelyk met behulp van chemies gesintetiseerde 3D20E (Fig. 4a-c) en kommersieel beskikbare 20E. Ons het waargeneem dat 3D20E aansienlik meer effektief was as 20E om vroulike sensitiwiteit vir paring by beide konsentrasies af te skakel (Fig. 4d). Dit is opmerklik dat die helfte van die fisiologiese vlak van 3D20E in die LRT (1 066 pg na inspuiting teenoor 2 022 pg na paring) 'n proporsie van vuurvaste wyfies veroorsaak het wat 20 keer hoër was as die fisiologiese vlak van 20E (361 pg na inspuiting) 24 uur na inspuiting by die hoogste konsentrasie 18 pg na paring; Uitgebreide Datatabel 1). Hierdie resultaat stem ooreen met die idee dat seksuele oordrag van 20E nie paringsvryperiodes veroorsaak nie, en wys verder na 3D20E as 'n belangrike faktor om die ouer-kind-verhouding te verseker. 3D20E was ook beduidend meer aktief as 20E in eierleggingstoetse in maagdelike wyfies (Fig. 4e), wat daarop dui dat die normale eierleggingstempo wat ons waargeneem het na gedeeltelike EPP-stilmaak te wyte was aan die teenwoordigheid van oorblywende 3D20E-aktiwiteit wat steeds deur paringsgeïnduseerde vroulike faktore geproduseer word.
(a,b) 3D20E chemies gesintetiseer vanaf 20E (a) met baie hoë omskakeling/doeltreffendheid (data aangebied as gemiddelde ± sem van drie onafhanklike sintese-reaksies) (b).c, Massaspektrum (onderste helfte) stem presies ooreen met ekdisoon wat in gepaarde vroulike LRT gevind is (boonste helfte).d, In vergelyking met 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; Fisher se presiese toets, tweesydig) en 10% etanol (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; Fisher se presiese toets, tweesydig), terwyl 20E slegs by hoër dosisse (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; Fisher se presiese toets, tweesydig) beduidend hoër was as die kontrole. Inspuiting het beduidend hoër kuitskietkoerse in maagdwyfies veroorsaak as 10% etanol-kontroles (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; Fisher se presiese toets, tweesydig), terwyl 20E in vergelyking met kontroles was. Slegs by hoër dosisse (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; Fisher se presiese toets, tweesydig).3D20E het beduidend hoër kuitskietkoerse veroorsaak as 20E by hoër dosisse (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; Fisher se presiese toets, tweesydig). In alle panele verteenwoordig n die aantal biologies onafhanklike muskietmonsters. NS, nie beduidend nie. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Data is afkomstig van drie replikate.
In vorige studies het ons bepaal dat seksuele oordrag van steroïedhormone die uitdrukking van MISO (Paringsgeïnduseerde Stimulator van Oogenese 11) veroorsaak, 'n vroulike voortplantingsgeen wat A. gambiae-wyfies teen P. falciparum-infeksie beskerm. Gesondheidskoste veroorsaak deur 13, die dodelikste menslike malariaparasiet. Gegewe die belangrikheid van MISO vir die voortplantingsfiksheid van Anopheles in malaria-endemiese gebiede, het ons besluit om te bepaal watter hormoon 3D20E of 20E die uitdrukking van hierdie geen veroorsaak. Ons het gevind dat terwyl 20E-inspuiting spesifiek of meer kragtig sommige kernhormoonreseptore (HR), soos HR3 en HR4, en tipiese stroomaf steroïedteikens, soos die geelkogene gene Vg14, 15, 16, geïnduseer het, MISO sterker geïnduseer is deur 3D20E (Uitgebreide Data Fig. 3). Dus blyk die seksuele oordrag van hierdie androgene steroïedhormoon meganismes te veroorsaak wat wyfies beskerm teen die koste wat deur parasitiese infeksie veroorsaak word. Verder beïnvloed 3D20E differensieel beide isovorme van die E-reseptor EcR, wat EcR-A induseer en EcR-B onderdruk, en ander paringsinduserende gene, insluitend HPX15, wat vroulike vrugbaarheid beïnvloed, sterker aktiveer. Dit kan die beduidende onvrugbaarheid verklaar wat waargeneem word in wyfies wat gepaar is met EPP-gestilde mannetjies (Uitgebreide Data Fig. 3). Hierdie data dui op die bestaan ​​van stroomaf-paaie wat verkieslik geaktiveer word deur twee ekdisoonhormone wat moontlik geslagspesifieke funksie onderlê.
Volgende het ons die funksie van die twee EcK-gene wat in ons bioinformatika-pyplyn geïdentifiseer is, getoets. Die stilmaak van EcK1 of EcK2 het gelei tot beduidende mortaliteit by mans (Uitgebreide Data Fig. 4a), wat daarop dui dat ekdisoonfosforilering, en dus inaktivering, belangrik is vir oorlewing. Omdat EcK2 op hoër vlakke as EcK1 uitgedruk is en in MAG's deur proteomika opgespoor is (Fig. 2b, c en Aanvullende Tabel 2), het ons die ekdisteroïedkinase-aktiwiteit daarvan gevalideer deur dit met 20E te inkubeer, wat gelei het tot fosforilering van 20E22P (Uitgebreide Data Fig. 2).4b). Met die gebruik van 3D20E as 'n substraat kon ons nie die gefosforileerde produk 3D20E22P opspoor nie (Uitgebreide Data Fig. 4c), wat daarop dui dat 20E eerder as 3D20E die voorkeurteiken van EcK2 kan wees.
Volgens ons RNA-seq-analise was EcK2 ook hoogs uitgedruk in die LRT van maagdelike wyfies, waar dit na paring afgeskakel is (Fig. 2b). Ons het hierdie data bevestig en bepaal dat EcK2-uitdrukking nie deur bloedvoeding beïnvloed is nie (Uitgebreide Data Fig. 5a). Deur ons aanvanklike MS-eksperimente uit te brei, het ons bepaal dat die piek van 20E22P nou verwant was aan die piek van 20E (22-26 uur na bloedmaaltyd; Uitgebreide Data Fig. 5b). Stilmaak van EcK2 in maagdelike wyfies het gelei tot 'n 3-voudige toename in die relatiewe verhouding van 20E tot 20E22P 26 uur na bloedmaaltyd (Uitgebreide Data Figure 2c en 5c), wat bevestig dat EcK2 ook 20E in wyfies fosforileer. Dit is opmerklik dat EcK2-uitgeputte maagde volle seksuele ontvanklikheid gehandhaaf het (Uitgebreide Data Fig. 5d,e), wat verder daarop dui dat vroulike produksie van 20E nie paringsvuurvaste periodes veroorsaak nie. Hierdie wyfies het egter beduidend... verhoogde eierleggingstempo's in vergelyking met kontroles, met meer as 30% van maagde wat eiers lê (Uitgebreide Data Fig. 5f). Indien dubbelstrengige Eck2 RNA (dsEcK2) inspuitings na bloedvoeding uitgevoer is, het paaiing nie plaasgevind nie, waarna die 20E-piek as gevolg van bloedinname afgeneem het. Oor die algemeen ondersteun hierdie resultate 'n model dat 20E wat na bloedsuiging geproduseer word, paaiing kan veroorsaak, maar slegs wanneer die paaiblok (EcK2 en moontlik ander faktore) deur paring afgeskakel word. Nóg 20E nóg 3D20E inspuitings het EcK2-uitdrukking in maagde geïnhibeer (Uitgebreide Data Fig. 5g), wat daarop dui dat ander faktore die inhibisie van hierdie kinase medieer. 20E-vlakke na bloedvoeding was egter nie voldoende om paringsongemak te veroorsaak nie, maar is effektief veroorsaak deur hoë titers van seksueel oordraagbare 3D20E.
Ons resultate bied belangrike insigte in die meganismes wat die reproduktiewe sukses van A. gambiae reguleer. 'n Model het na vore gekom waar mannetjies ontwikkel het om hoë titers van 3D20E te sintetiseer, 'n manlik-spesifieke gemodifiseerde ekdisoon wat ouerskap verseker deur wyfies te desensibiliseer vir verdere paring. Terselfdertyd het hierdie malariavektore ook 'n doeltreffende stelsel ontwikkel om 3D20E in wyfies te aktiveer in reaksie op die seksuele oordrag van manlik-spesifieke EPP. Na ons wete is dit die eerste voorbeeld van 'n manlik- en vroulik-gedomineerde steroïedhormoonstelsel wat 'n unieke en kritieke funksie in insekte verrig. Manlik-spesifieke ekdisoonfunksie is gepostuleer, maar nie definitief gedemonstreer nie. Byvoorbeeld, 'n grootliks weerlêde hipotese 18 is dat hierdie funksies deur die 20E-voorloper E1 uitgevoer kan word. Dit is welbekend dat monandrie in Drosophila veroorsaak word deur die seksuele oordrag van klein geslagspeptiede 19,20 wat interaksie het met neurone wat die vroulike voortplantingskanaal innerveer deur spesifieke geslagspeptiedreseptore 21,22. Verdere werk is nodig om die stroomaf seintransduksie te bepaal. kaskades wat deur 3D20E in A. gambiae-wyfies beheer word en om te bepaal of hierdie kaskades tussen muskiete en Drosophila bewaar kan word.
Gegewe die belangrike rol van 3D20E op vroulike vrugbaarheid en gedrag wat in ons studie geïdentifiseer is, bied die weë wat lei tot 3D20E-sintese en -aktivering nuwe geleenthede vir toekomstige muskietbeheerstrategieë, soos die generering van mededingende steriele mannetjies in steriele insektegnologiestrategieë. Gebruik vir wilde vrylating of om die 3D20E in maagdelike spel na te boots. Die mannetjie-spesifieke funksie van 3D20E het moontlik ontwikkel toe A. gambiae en ander Cellia-spesies die vermoë verkry het om hul semen in paringsproppe te koaguleer, aangesien dit die doeltreffende oordrag van groot getalle hormone en hormoon-aktiverende ensieme moontlik maak. Op sy beurt bied 3D20E-evolusie wat monandry implementeer, 'n meganisme vir wyfies (deur hoë uitdrukking van MISO) om hul reproduktiewe fiksheid in gebiede met hoë malaria-voorkoms te bevoordeel, wat indirek bydra tot Plasmodium-oordrag. Aangesien vroulike 20E getoon het dat dit diepgaande effekte op die oorlewing en groei van P. falciparum in vroulike Anopheles-muskiete het,24 is beide manlike en vroulike steroïedhormoonweë nou sleutelaspekte van muskiet-parasiet-interaksies.
A. gambiae G3-stamme is onder standaard insektoestande grootgemaak (26-28 °C, 65-80% relatiewe humiditeit, 12:12 uur lig/donker fotoperiode). Larwes is gevoer met poeiermelk visvoer (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets en Tetra Pond Sticks in 'n verhouding van 7:7:2). Volwasse muskiete is ad libitum gevoer met 'n 10% dekstrose-oplossing en weeklikse menslike bloed (studiebloedkomponente). Maagdmuskiete is verkry deur die geslagte in die papiestadium te skei nadat die punte deur mikroskopie ondersoek is. Mannetjies wat die DsRed-transgeen dra, is voorheen beskryf.
Gedwonge paringseksperimente is uitgevoer volgens voorheen beskryfde protokolle. Vir natuurlike paring is 4 dae oue maagdelike wyfies vir twee nagte in 'n 1:3-verhouding met seksueel volwasse maagdelike mannetjies gehou. Vir eksperimente waarin mannetjies met dsEPP ingespuit is, het die ko-hokverband saamgeval met dae 3-4 na inspuiting, toe fosfatase-aktiwiteit maksimaal stilgemaak is (Uitgebreide Data Fig. 2b).
Muskietweefsel, oorblywende kadawers (res van die liggaam), of die hele liggaam is in 100% metanol gedissekteer en gehomogeniseer met 'n kralemaker (2 mm glaskrale, 2 400 rpm, 90 sek). Weefselhoeveelhede en metanolvolumes was soos volg: res van liggaam, 50 in 1 000 µl; MAG, 50–100 80 µl; vroulike LRT, 25–50 80 µl. Die presipitaat is onderwerp aan 'n tweede metanol-ekstraksie met dieselfde volume metanol. Selrommel is verwyder deur sentrifugering. Die metanol van beide ekstraksies is gekombineer en gedroog onder stikstofvloei, en dan hersuspendeer in die volgende volumes van 80% metanol in water: res van die liggaam, 50 µl; MAG's en vroulike LRT, 30 µl.
Monsters is geanaliseer op 'n massaspektrometer (ID-X, Thermo Fisher) gekoppel aan 'n LC-instrument (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl van die monster is ingespuit op 'n 3 µm, 100 × 4.6 mm kolom (Inspire C8, Dikma) wat by 25 °C gehou is. Die mobiele fases vir die LC was A (water, 0.1% mieresuur) en B (asetonitriel, 0.1% mieresuur). Die LC-gradiënt was soos volg: 5% B vir 1 minuut, dan verhoog tot 100% B oor 11 minute. Na 8 minute teen 100%, ewewig die kolom weer by 5% B vir 4 minute. Die vloeitempo was 0.3 ml min-1. Ionisasie in die MS-bron word bewerkstellig deur verhitte elektrosproei-ionisasie in positiewe en negatiewe modusse.
Die massaspektrometer meet data in die m/z-reeks van 350 tot 680 teen 60 000 resolusie in volle MS-modus. MS/MS-data is verkry op [M + H]+ (alle teikens), [M - H2O + H]+ (alle teikens), en [M - H]- (gefosforileerde teikens). MS/MS-data is gebruik om die ekdisoon-eienskappe van teikens waarvoor geen standaard beskikbaar was, te bevestig. Om nie-geteikende ekdisteroïede te identifiseer, is MS/MS-data vir alle HPLC-pieke met >15% relatiewe oorvloed geanaliseer. Kwantifiseer met behulp van standaardkrommes wat uit suiwer standaarde (20E, 3D20E) geskep is om absolute hoeveelhede of verdunnings van een spesifieke monster (alle ander teikens) te bereken om hul ekwivalensie met die hoeveelhede wat in een man gevind is, te bereken. Vir 3D20E is kwantifisering uitgevoer met behulp van die som van die volgende addukte: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Data is onttrek en gekwantifiseer met behulp van Tracefinder (weergawe 4.1).MS/MS-data is geanaliseer met behulp van Xcalibur (weergawe 4.4).Die MS-spektra van E, 20E en 3D20E is vergelyk met die onderskeie standaarde.3D20E22P is geanaliseer deur derivatisering met Girard se reagens.20E22P is geanaliseer volgens die m/z-verhouding.
3D20E22P is gesuiwer uit MAG. Suiwering is op 'n analitiese skaal uitgevoer met behulp van 'n ultra-prestasie vloeistofchromatograaf (Acquity, Waters) met 'n kwadrupool massa-gebaseerde detektor (QDa, Acquity, Waters) onder dieselfde LC-toestande as die HPLC-MS/MS-analise. Fraksie-versameling is geaktiveer toe die m/z wat ooreenstem met 3D20E22P, waargeneem is teen dieselfde retensietyd as voorheen bepaal. Die suiwerheid van die geëkstraheerde verbindings is toe gekontroleer deur HPLC-MS/MS soos hierbo beskryf.
Totale RNS is uit 10-12 voortplantingsweefsels of ander dele van die liggaam (koploos) onttrek met behulp van TRI-reagens (Thermo Fisher) volgens die vervaardiger se instruksies. RNS is behandel met TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNS is gesintetiseer met behulp van Moloney-murienleukemievirus-omgekeerde transkriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) volgens die vervaardiger se instruksies. Primers vir omgekeerde transkripsie kwantitatiewe PCR (RT-qPCR; Uitgebreide Datatabel 2) is voorheen gepubliseer24 of ontwerp met behulp van Primer-BLAST26, met voorkeur gegee aan produkte van 70-150 bp in grootte en wat ekson-ekson-aansluitings omspan, of Primerpaarprimers skei eksone. cDNS-monsters van drie tot vier biologiese replikate is viervoudig in water verdun vir RT-qPCR. Kwantifisering is uitgevoer in 15 µl replikaatreaksies wat 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primers en 5 µl verdunde cDNS bevat. Reaksies is op 'n QuantStudio 6 Pro intydse modus uitgevoer. PCR-stelsel (Thermo Fisher) en data is versamel en geanaliseer met behulp van Design and Analysis (weergawe 2.4.3). Soos in hierdie studie gedemonstreer, is relatiewe hoeveelhede genormaliseer na die ribosomale geen RpL19 (AGAP004422), waarvan die uitdrukking nie beduidend verander het met bloedvoeding 27 of paring 3 nie.
RNS-kwaliteit is nagegaan met behulp van 'n Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Illumina gepaarde-end biblioteke is voorberei en by die Broad Institute van MIT en Harvard uitgevoer. Volgordebepalingslesings is in lyn gebring met die A. gambiae genoom (PEST-stam, weergawe 4.12) met behulp van HISAT2 (weergawe 2.0.5) met standaardparameters. Lesings met karteringskwaliteit (MAPQ) tellings <30 is verwyder met behulp van Samtools (weergawe 1.3.1). Die aantal lesings wat aan gene gekarteer is, is getel met behulp van htseq-count (weergawe 0.9.1) met standaardparameters. Genormaliseerde leestellingtellings is bereken en differensiële geenekspressie is geanaliseer met behulp van die DESeq2-pakket (weergawe 1.28.1) in R (weergawe 4.0.3).
Ekdisoon-modifiserende geenkandidate is geïdentifiseer deur eers die A. gambiae-genoom te deursoek met behulp van die PSI-BLAST-algoritme (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), met behulp van standaardwaardes Parameters met die volgende navraagproteïenreekse: van Bombyx mori (Toegangsnr. NP_001038956.1), Musca domestica (Toegangsnr. XP_005182020.1, XP_005175332.1 en XP_011294434.1) en Microplitis demolitor (Toegangsnr. XP_008552646.1 en XP_008552645.1) EcK van B. mori (Toegangsnr. NP_001036900), Drosophila melanogaster (Toegangsnr. NP_651202), Apis mellifera (Toegangsnr. XP_394838) en Acyrthosiphon pisum (Toegangsnr. XP_001947166); en EPP van B. mori (Toegangsnr. XP_001947166) NP_001177919.1 en NP_001243996.1) en EO van D. melanogaster (Toegangsnr. NP_572986.1) (stap 1). Filtreer vervolgens treffers gebaseer op hoë mRNA-ekspressie (>100 fragmente/kilobase-eksons per miljoen gekarteerde lesings (FPKM) of >85%) in voortplantingsweefsel (vroulike LRT of MAG) in Gambië (stap 2). Om spesifisiteit te verbeter, het ons kandidaatensieme gekies wat ook uitgedruk word in die voortplantingsweefsel van A. albimanus, 'n anopheles-spesie wat nie ekdisoon sintetiseer of oordra tydens paring nie. Kandidaatgene is gefiltreer gebaseer op lae uitdrukking (<100 FPKM of <85ste persentiel) in A. albimanus-voortplantingsweefsel (stap 3). As 'n finale filter (stap 4) moet kandidaatgene ten minste een van die volgende bevredig: (1) beduidend opgereguleer na paring (P < 0.05) volgens die analise van differensieel uitgedrukte gene en (2) in nie-voortplantingsweefsels (< 85% of <100 FPKM).
Ons het voorheen beskryfde metodes 28,29,30 gewysig om isotopiese etikettering van die hele organisme te verkry. Kortliks, wilde-tipe Saccharomyces cerevisiae tipe II (YSC2, Sigma) is getoets in gis stikstofbasis (BD Difco, DF0335) wat (gew/vol) 2% glukose (G7528, Sigma), 1.7% aminosuurvrye en ammoniumsulfaat-kultuurmedium) en 5% 15N ammoniumsulfaat (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) as die enigste bron van stikstof bevat. Gis is herwin deur sentrifugering en muskietlarwes is ad libitum gevoer tot verpoping. Aanvulling met vismeel (0.5 mg per 300 larwes) om vierde instar-mortaliteit te voorkom. Slegs wyfies is toe gebruik in paringseksperimente met ongemerkte mannetjies om die manlike proteoom wat tydens paring oorgedra is, te analiseer.
4-6 dae oue 15N-gemerkte maagdelike wyfies is gedwing om te paar met ouderdomsgepaste ongemerkte maagdelike mannetjies. Suksesvolle paring is geverifieer deur paringsproppe onder epifluoresensiemikroskopie op te spoor. By 3, 12 en 24 hpm is die atria van 45-55 gepaarde wyfies in 50 µl ammoniumbikarbonaatbuffer (pH 7.8) gedissekteer en met 'n stamper gehomogeniseer. Die homogenaat is gesentrifugeer en die supernatant gemeng met 50 µl 0.1% RapiGest (186001860, Waters) in 50 mM ammoniumbikarbonaat. Die supernatant en pellet van elke monster is op droë ys gevries en oornag na die MacCoss-laboratorium aan die Universiteit van Washington gestuur, waar monstervoorbereiding vir LC-MS/MS voltooi is. Hersuspendeer die pellet in 50 µl 0.1% RapiGest in 50 mM ammoniumbikarbonaat en sonikeer in 'n waterbad. Die proteïenkonsentrasie van die pellet en supernatant is gemeet deur die BCA-toets, monsters is gereduseer met 5 mM ditiotreitol (DTT; Sigma), gealkyleer met 15 mM jodoasetamied (Sigma) en geïnkubeer by 37 °C (1:0 50) vir 1 uur met tripsinisering: tripsin:substraatverhouding). RapiGest is geliseer deur die byvoeging van 200 mM HCl, gevolg deur inkubasie by 37 °C vir 45 minute en sentrifugering by 14 000 rpm vir 10 minute by 4 °C om puin te verwyder. Monsters is gewas deur dubbelmodus vastefase-ekstraksie (Oasis MCX-patrone, Waters) en hersuspendeer in 0,1% mieresuur vir 'n finale proteïenkonsentrasie van 0,33 µg µl-1. Ongemerkte MAG-proteome is soortgelyk van maagdelike mans geanaliseer. Twee analitiese replikate is vir elke monster geanaliseer. Vervolgens is 1 µg van elk geanaliseer met behulp van 'n 25 cm gesmelte silika 75 μm kolom met 'n 4-cm gesmelte silika Kasil1 (PQ) fritval gepak met Jupiter C12 omgekeerde-fase hars (Phenomenex) en 180-minuut vloeistofchromatografie. Monsterverterings – MS/MS is uitgevoer op 'n Q-Exactive HF massaspektrometer (Thermo Fisher) met 'n nanoACQUITY UPLC-stelsel (Waters). Dataverwante verkrygingsdata wat vir elke lopie gegenereer is, is omgeskakel na mzML-formaat met behulp van Proteowizard (weergawe 3.0.20287) en met behulp van Comet31 (weergawe 3.2) teen die FASTA-databasis wat proteïenvolgordes van Anopheles gambiae (VectorBase weergawe 54), Anopheles coluzzi bevat. 'n Soektog is uitgevoer op Mali-NIH (VectorBase weergawe 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Maart 2021), A. gambiae RNA-seq, en drie-raam-translasies van bekende menslike kontaminante. Peptiedkaart-ooreenstemmende FDR's is bepaal met behulp van Percolator32 (weergawe 3.05) met 'n drempel van 0.01, en peptiede is saamgestel in proteïenidentifikasies met behulp van proteïenparsimonie in Limelight33 (weergawe 2.2.0). Relatiewe proteïenoorvloed is beraam deur die genormaliseerde spektrale oorvloedfaktor (NSAF) te gebruik wat vir elke proteïen in elke lopie bereken is soos voorheen beskryf. NSAF relatief tot elke proteïen is gemiddeld oor monsters van twee verskillende biologiese replikate. 15N-etikettering het die vroulike proteoom suksesvol gemasker, hoewel 'n klein hoeveelheid ongemerkte proteïen van die gemerkte maagde opgespoor kon word. Ons het die opsporing van manlike proteïenreduksie (1-5 spektra) in vroulike rou monsters slegs in tegniese lopies aangeteken, waar rou monsters na manlike/paringsmonsters uitgevoer is, as gevolg van HPLC-"oordrag". Af en toe proteïene wat as 'kontaminante' van gemerkte maagde gevind word, word in Aanvullende Tabel 1 gelys.
Twee antigeniese peptiede, QTTDRVAPAPDQQQ (binne isotipe PA) en MESDGTTPSGDSEQ (binne isotipe PA en PB) in Genscript. Die twee peptiede is gekombineer, dan gekonjugeer aan die draerproteïen KLH en in Nieu-Seelandse konyne ingespuit. Die konyne is na die vierde inspuiting geoffer, en totale IgG is geïsoleer deur affiniteitssuiwering. IgG van die mees EPP-spesifieke konyn is gebruik vir verdere western blotting.
Vir western blots, MAG (n = 10, waar n die aantal biologies onafhanklike muskietmonsters verteenwoordig) en vroulike LRT (n = 30) van 4 dae oue maagdelike mannetjies en maagdelike of gedwonge paarde wyfies (<10 na paring), is proteïenekstraksiebuffer (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% natriumdeoksicholaat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× protease-inhibeerder-mengsel (Roche)) afsonderlik bygevoeg. Monsters is onmiddellik na disseksie gehomogeniseer met 'n kralemaker (2 mm glaskrale, 2 400 rpm, 90 sek). Onoplosbare puin is verwyder deur sentrifugering teen 20 000 g by 4 °C. Proteïene is gekwantifiseer deur Bradford-toets (Bio-Rad). Daarna is 20 µg MAG-proteïen, 40 µg LRT-proteïen en 20 µg oorblywende grootmaatproteïen gedenatureer en geskei deur 10% Bis-Tris NuPAGE met behulp van MOPS-buffer. Proteïene is oorgedra na polivinilideenfluoriedmembrane met behulp van die iBlot2-oordragstelsel (Thermo Fisher). Membrane is twee keer gewas in 1× PBS-T (0.1% Tween-20 in PBS) en toe geblokkeer in Odyssey-blokkeringsbuffer (Li-Cor) vir 1 uur by 22°C. Membrane is oornag geskud by 4°C met 'n pasgemaakte konyn-anti-EPP poliklonale primêre teenliggaam (1:700 in blokkeringsbuffer) en rot-anti-aktien monoklonale primêre teenliggaam MAC237 (Abeam; 1:4 000). Membrane is gewas met PBS-T en toe geïnkubeer met sekondêre teenliggaampies (donkie-anti-konyn 800CW en bok-anti-rot 680LT (Li-Cor), beide 1:20 000) in blokkeringsbuffer wat 0.01% SDS en 0.2% Tween-20 bevat vir 1 uur by 22. °C. Membrane is met PBS-T gewas en met 'n Odyssey CLx-skandeerder afgebeeld. Beelde is in Image Studio (weergawe 5.2) versamel en verwerk. 'n Spesifieke band wat ooreenstem met die EPP-RA-isovorm (82 kDa) is nie opgespoor nie.
Die koderende streke van EPP (as isovorm AGAP002463-RB wat histidienfosfatasedomein bevat, NCBI gekonserveerde domeinsoektog 34) en EcK2 (AGAP002181) is in pET-21a(+) plasmied (Novagen Millipore Sigma) gekloon; Die primers word in Uitgebreide Data Tabel 2 gelys. Agt GS4-skakelaars (in tandem) is voor die C-terminale 6xHis-merker van die pET-21a(+)-EcK2-konstruk ingevoeg. Rekombinante proteïene is geproduseer met behulp van die NEBExpress-selvrye E. coli-proteïensintesereaksie (New England BioLabs). Rekombinante proteïene is gesuiwer met behulp van NEBExpress Ni-spinkolomme (New England BioLabs). Dihidrofolaatreduktase (DHFR)-kontroleproteïen is geproduseer met behulp van die DNA-sjabloon van die NEBExpress-selvrye E. coli-proteïensintesekit. Proteïene is vir tot 3 maande in 50% gliserol in PBS by -20 °C gestoor.
Fosfatase-aktiwiteit van EPP en weefselekstrakte is gemeet met behulp van 4-nitrofenielfosfaat (pNPP; Sigma-Aldrich). Die reaksiebuffer het 25 mM Tris, 50 mM asynsuur, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA en 1 mM DTT bevat. Weefsel is in reaksiebuffer gehomogeniseer en selorebuit is deur sentrifugering verwyder. Begin die reaksie deur ensiem- of weefselekstrak by reaksiebuffer te voeg wat 2.5 mg ml-1 pNPP bevat. Die reaksiemengsel is by kamertemperatuur in die donker geïnkubeer, en die hoeveelheid pNP wat van pNPP omgeskakel is, is gekwantifiseer deur die absorbansie by 405 nm op verskillende tye te meet.
Vir in vitro EcK-aktiwiteit is die proteïen geïnkubeer met 0.2 mg 20E of 3D20E in 200 µl buffer (pH 7.5) wat 10 mM HEPES-NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP en 10 mM MgCl2 bevat vir 2 uur by 27 °C. Die reaksie is gestop deur 800 µl metanol by te voeg, dan afgekoel by -20 °C vir 1 uur, en dan gesentrifugeer by 20 000 g vir 10 minute by 4 °C. Die supernatant is toe geanaliseer deur HPLC-MS/MS. Om die proteïene wat in die kontrolegroep gebruik is, hitte-inaktiveer, is die proteïene vir 20 minute by 95 °C in 50% gliserol in PBS geïnkubeer.
Vir in vitro EPP-aktiwiteit is die proteïen geïnkubeer met 3D20E22P (ekwivalent aan die hoeveelheid wat in 18 pare MAG gevind word, gesuiwer deur HPLC-MS/MS) in 100 µl buffer (pH 7.5) wat 25 mM Tris, 50 mM asynsuur, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA en 1 mM DTT bevat vir 3 uur by 27 °C. Die reaksie is gestop deur 400 µl metanol by te voeg en vir 1 uur by -20 °C afgekoel, en daarna vir 10 minute by 4 °C by 20 000 g gesentrifugeer. Die supernatant is deur HPLC-MS/MS geanaliseer.
PCR-fragmente vir EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) en EcK2 (556 bp) is geamplifiseer vanaf cDNA wat voorberei is vanaf kadawers van gemengde geslagte koplose muskiete. Die PCR-fragment van die eGFP-kontrole (495 bp) is geamplifiseer vanaf die voorheen beskryfde pCR2.1-eGFP; PCR-primers word in Uitgebreide Data Tabel 2 gelys. Die PCR-fragment is tussen die omgekeerde T7-promotors op die pL4440-plasmied ingevoeg. Plasmiedkonstrukte is herwin van NEB 5-α-kompetente E. coli (New England Biolabs) en geverifieer deur DNA-volgordebepaling voor gebruik (sien Aanvullende Data 1 vir invoegvolgorde). Primers wat ooreenstem met die T7-promotor (Uitgebreide Data Tabel 2) is gebruik om die invoegsel van die pL4440-gebaseerde plasmied te amplifiseer. PCR-produkgrootte is bevestig deur agarosegelelektroforese. dsRNA is getranskribeer van PCR-sjablone met behulp van die Megascript T7 Transkripsie Kit (Thermo Fisher) en gesuiwer volgens die vervaardiger se instruksies met die wysigings wat voorheen beskryf is.
Vir dsRNA-inspuiting is 1 380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) binne 1 dag na eclosion teen 'n konsentrasie van 10 ng nl-1 in die toraks van volwasse mans of wyfies (Nanoject III, Drummond) ingespuit. Geen-uitklopvlakke is in ten minste drie biologiese replikate bepaal deur RNA-ekstraksie, cDNA-sintese en RT-qPCR. Vir ecdysone-inspuiting is 4 dae oue maagdelike of 6 dae oue maagdelike bloedgevoerde wyfies ingespuit met 0,13, 0,21 of 0,63 µg 20E of 3D20E (Nanoject III, Drummond) teen konsentrasies van onderskeidelik 1,3, 2,1, afhangende van die eksperimentele ontwerp of 6,3 ng nl-1. Spuit 100 nl 10% (vol/vol) etanol in water in; 100 nl van 3D20E22P in 10% etanol (gelykstaande aan 75% van die hoeveelheid wat in 'n paar MAG's gevind word). Muskiete is ewekansig aan die inspuitgroep toegewys.
Vir paai-toetse is 3 dae oue wyfies ad libitum met menslike bloed gevoer. Verwyder gedeeltelik gevoede of onvervoede muskiete. Afhangende van die behandeling, is wyfies vir vier nagte, ten minste 48 uur na die bloedmaaltyd, in aparte paaibekers geplaas. Eiers is onder 'n stereoskoop (Stemi 508, Zeiss) getel; vir gepaarde wyfies is eiers wat in larwes uitgebroei het, as vrugbaar beskou.
Vir paringsproewe is wyfies, afhangende van die behandeling, ten minste 2 dae toegelaat om weerstand teen paring te ontwikkel, en wilde-tipe ouderdomsgepaarde mannetjies is daarna in dieselfde hok geplaas. Twee nagte later is die bevrugte wyfies se vesikels gedissekteer en genomiese DNS is vrygestel deur vries-ontdooi en sonikasie in 'n buffer wat 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA en 25 mM NaCl (pH 8.2) bevat. Monsters is vir 15 minute by 55 °C met Proteinase K (0.86 µg µl-1) geïnkubeer, gevolg deur 10 minute by 95 °C. Ru genomiese DNS-preparate is 10-voudig verdun en onderwerp aan qPCR-deteksie van Y-chromosoomvolgordes; primers word in Uitgebreide Data Tabel 2 gelys. Afwesigheid van Y-chromosoomvolgorde dui op geen paring nie.
Vir herparingstoetse is gedwonge gepaarde wyfies ondersoek vir die teenwoordigheid van paringsproppe om paringsstatus te bevestig en het 2 dae toegelaat om weerstandbiedend te wees teenoor paring in die afwesigheid van mannetjies te ontwikkel, soos voorheen beskryf 36. Mannetjies wat DsRed transgeniese sperm dra, is toe in wyfiehokke geplaas. Twee nagte later is die bevrugtende vesikels van die wyfies gedissekteer, en genomiese DNS is soos hierbo beskryf voorberei en onderwerp aan qPCR-opsporing van die DsRed-transgeen; primers word in Uitgebreide Datatabel 2 gelys. Die afwesigheid van die DsRed-transgeen het aangedui dat geen herparing plaasgevind het nie.
3D20E is gesintetiseer soos voorheen beskryf 37. Kortliks, 10 mg van 20E (Sigma-Aldrich) is in 10 ml water opgelos, gevolg deur die byvoeging van 30 mg platinum swart (in poeiervorm, Sigma-Aldrich). 'n Sagte stroom O2 is voortdurend in die reaksiemengsel geborrel, wat by kamertemperatuur geroer is. Na 6 uur is 30 ml metanol bygevoeg om die reaksie te stop. Die mengsel is gesentrifugeer om katalisatordeeltjies te verwyder. Die supernatant is in vakuum by kamertemperatuur tot droogheid verdamp. Die gedroogde reaksieproduk is in 10% etanol en metanol opgelos vir inspuiting vir HPLC-MS/MS-analise. Die omskakelingskoers (van 20E na 3D20E) was ongeveer 97% (Fig. 4b), en die MS-spektrum van die gesintetiseerde 3D20E het ooreengestem met dié wat in gepaarde wyfies gevind is (Fig. 4c).
Die legende bevat spesifieke besonderhede van die statistiese toetse wat uitgevoer is. GraphPad (weergawe 9.0) is gebruik om Fisher se eksakte toets, Mantel-Cox-toets en Student se t-toets uit te voer. Cochran-Mantel-Haenszel-toetse is uitgevoer met behulp van 'n persoonlike R-skrip (beskikbaar by https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Die dataverspreiding is getoets vir normaliteit met behulp van die Shapiro-Wilk-toets met 'n betekenisdrempel van 0.05. Wanneer die data die normaliteitstoets gedruip het, is die Mann-Whitney-toets uitgevoer. Oorlewingsdata is geanaliseer met behulp van die Mantel-Cox-toets. Die DESeq2-pakket (weergawe 1.28.1) is gebruik om RNA-seq geenvlak-differensiële ekspressie-analise uit te voer. Die horisontale staaf op die grafiek verteenwoordig die mediaan. 'n Betekeniswaarde van P = 0.05 is as die drempel vir alle toetse gebruik.
Vir meer inligting oor die studie-ontwerp, sien die Nature Research Report-opsomming wat aan hierdie artikel gekoppel is.
MS-proteomiese data is in die ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) gedeponeer deur die PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) met die datastel-identifiseerder PXD032157.
Die RNA-seq-datastel is gedeponeer in die Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) onder die reeksrekord GSE198665.
Bykomende datastelle wat tydens die huidige studie gegenereer en/of geanaliseer is, kan op redelike versoek van die ooreenstemmende outeurs verkry word. Hierdie artikel verskaf die brondata.
De Loof, A. Ekdisteroïede: Verwaarloosde insekgeslagsteroïede? Manlik: Black Box. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroksiekdisoon en ovariale ontwikkeling in Anopheles stephens. J. Insekfisiologie. 28, 97–109 (1982).