Immunomodulerende metaboliete is 'n sleutelkenmerk van die tumor-mikroomgewing (TME), maar met 'n paar uitsonderings bly hul identiteite grootliks onbekend. Hier het ons gewasse en T-selle van die gewasse en ascites van pasiënte met hoëgraadse sereuse karsinoom (HGSC) geanaliseer om die metaboloom van hierdie verskillende TME-kompartemente te openbaar. Ascites en tumorselle het uitgebreide metabolietverskille. In vergelyking met ascites, is die tumor-infiltrerende T-selle aansienlik verryk in 1-metielnikotinamied (MNA). Alhoewel die vlak van MNA in T-selle verhoog is, is die uitdrukking van nikotienamied N-metieltransferase (’n ensiem wat die oordrag van metielgroepe van S-adenosielmetionien na nikotienamied kataliseer) beperk tot fibroblaste en tumorselle. Funksioneel veroorsaak MNA dat T-selle die tumorbevorderende sitokien tumornekrosefaktor alfa afskei. Daarom dra TME-afgeleide MNA by tot die immuunregulering van T-selle en verteenwoordig 'n potensiële immunoterapie-teiken vir die behandeling van menslike kanker.
Tumor-afgeleide metaboliete kan 'n diepgaande inhiberende effek op antitumor-immuniteit hê, en meer en meer bewyse toon dat hulle ook as 'n sleuteldryfkrag vir siekteprogressie kan dien (1). Benewens die Warburg-effek, het onlangse werk begin om die metaboliese toestand van tumorselle en die verband daarvan met die immuuntoestand van die tumor-mikroomgewing (TME) te karakteriseer. Studies oor muismodelle en menslike T-selle het getoon dat glutamienmetabolisme (2), oksidatiewe metabolisme (3) en glukosemetabolisme (4) onafhanklik op verskeie immuunsel-subgroepe kan optree. Verskeie metaboliete in hierdie weë inhibeer die antitumorfunksie van T-selle. Daar is bewys dat die blokkade van die koënsiem tetrahidrobiopterin (BH4) die proliferasie van T-selle kan beskadig, en die toename van BH4 in die liggaam kan die antitumor-immuunrespons wat deur CD4 en CD8 gemedieer word, verbeter. Daarbenewens kan die immuunonderdrukkende effek van kynurenien gered word deur die toediening van BH4 (5). In isositraatdehidrogenase (IDH) mutant glioblastoom, inhibeer die afskeiding van enantiometaboliese (R)-2-hidroksiglutaraat (R-2-HG) T-selaktivering, proliferasie en sitolise-aktiwiteit (6). Onlangs is aangetoon dat metielglioksaal, 'n neweproduk van glikolise, deur onderdrukker selle van mieloïde oorsprong geproduseer word, en T-sel-oordrag van metielglioksaal kan effektor T-selfunksie inhibeer. In behandeling kan die neutralisering van metielglioksaal die aktiwiteit van mieloïde-afgeleide onderdrukker selle (MDSC) oorkom en sinergisties kontrolepuntblokkade-terapie in muismodelle verbeter (7). Hierdie studies beklemtoon gesamentlik die sleutelrol van TME-afgeleide metaboliete in die regulering van T-selfunksie en -aktiwiteit.
T-sel-disfunksie is wyd gerapporteer in eierstokkanker (8). Dit is deels te wyte aan die metaboliese eienskappe inherent aan hipoksie en abnormale tumorvaskulatuur (9), wat lei tot die omskakeling van glukose en triptofaan in neweprodukte soos melksuur en kinurenien. Oormatige ekstrasellulêre laktaat verminder die produksie van interferon-γ (IFN-γ) en dryf die differensiasie van myelosuppressiewe subgroepe aan (10, 11). Die verbruik van triptofaan inhibeer direk T-selproliferasie en inhibeer T-selreseptor-seintransduksie (12-14). Ten spyte van hierdie waarnemings, is baie werk rondom immuunmetabolisme uitgevoer in in vitro T-selkultuur met behulp van geoptimaliseerde media, of beperk tot homoloë muismodelle in vivo, wat nie die heterogeniteit van menslike kankers en fisiologiese makro- en mikro-omgewing ten volle weerspieël nie.
'n Algemene kenmerk van eierstokkanker is peritoneale verspreiding en die voorkoms van ascites. Die ophoping van selvloeistof in ascites word geassosieer met gevorderde siekte en swak prognose (15). Volgens berigte is hierdie unieke kompartement hipoksies, het hoë vlakke van vaskulêre endoteelgroeifaktor (VEGF) en indoleamien 2,3-dioksigenase (IDO), en word dit geïnfiltreer deur T-regulerende selle en mieloïde inhiberende selle (15-18). Die metaboliese omgewing van ascites kan verskil van dié van die gewas self, dus is die herprogrammering van T-selle in die peritoneale ruimte onduidelik. Daarbenewens kan die belangrikste verskille en heterogeniteit tussen ascites en metaboliete wat in die gewasomgewing teenwoordig is, die infiltrasie van immuunselle en hul funksie op gewasse belemmer, en verdere navorsing is nodig.
Om hierdie probleme op te los, het ons 'n sensitiewe selskeiding en vloeistofchromatografie tandem massaspektrometrie (LC-MS/MS) metode ontwerp om verskillende seltipes (insluitend CD4+ en CD8+ T-selle) sowel as binne en tussen gewasse te bestudeer. Die metaboliete daarvan strek oor selle in dieselfde ascites- en tumoromgewing van die pasiënt. Ons gebruik hierdie metode in samewerking met hoëdimensionele vloeisitometrie en enkelsel-RNA-volgordebepaling (scRNA-seq) om 'n hoogs opgeloste portret van die metaboliese status van hierdie sleutelpopulasies te verskaf. Hierdie metode het 'n beduidende toename in die vlak van 1-metielnikotinamied (MNA) in tumor-T-selle getoon, en in vitro-eksperimente het getoon dat die immunomodulerende effek van MNA op T-selfunksie voorheen onbekend was. Oor die algemeen onthul hierdie metode die wedersydse metaboliese interaksies tussen gewasse en immuunselle, en bied unieke insigte in immuunreguleringsmetaboliete, wat nuttig kan wees vir die behandeling van T-sel-gebaseerde eierstokkanker-immunoterapie-behandelingsgeleenthede.
Ons het hoëdimensionele vloeisitometrie gebruik om gelyktydig glukose-opname te kwantifiseer [2-(N-(7-nitrofeniel-2-oksa-1,3-diasa-4-iel)amino)-2-deoksiglukose (2-NBDG) en mitochondriale aktiwiteit [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) is tipiese merkers wat immuunselle en tumorselpopulasies onderskei (Tabel S2 en Figuur S1A). Hierdie analise het getoon dat ascites en tumorselle in vergelyking met T-selle hoër glukose-opnamevlakke het, maar kleiner verskille in mitochondriale aktiwiteit het. Die gemiddelde glukose-opname van tumorselle [CD45-EpCAM (EpCAM)+] is drie tot vier keer dié van T-selle, en die gemiddelde glukose-opname van CD4+ T-selle is 1.2 keer dié van CD8+ T-selle, wat aandui dat tumor-infiltrerende limfosiete (TIL) verskillende metaboliese vereistes het, selfs in dieselfde TME (Figuur 1A). In teenstelling hiermee is die mitochondriale aktiwiteit in tumorselle soortgelyk aan dié van CD4+ T-selle, en die mitochondriale aktiwiteit van beide seltipes is hoër as dié van CD8+ T-selle (Figuur 1B). Oor die algemeen toon hierdie resultate die metaboliese vlak. Die metaboliese aktiwiteit van tumorselle is hoër as dié van CD4+ T-selle, en die metaboliese aktiwiteit van CD4+ T-selle is hoër as dié van CD8+ T-selle. Ten spyte van hierdie effekte oor seltipes, is daar geen konsekwente verskil in die metaboliese status van CD4+ en CD8+ T-selle of hul relatiewe verhoudings in ascites in vergelyking met gewasse nie (Figuur 1C). In teenstelling hiermee het die verhouding van EpCAM+ selle in die tumor in die CD45-selfraksie toegeneem in vergelyking met ascites (Figuur 1D). Ons het ook 'n duidelike metaboliese verskil tussen EpCAM+ en EpCAM- selkomponente waargeneem. EpCAM+ (tumor) selle het hoër glukose-opname en mitochondriale aktiwiteit as EpCAM- selle, wat baie hoër is as die metaboliese aktiwiteit van fibroblaste in tumorselle in TME (Figuur 1, E en F).
(A en B) Mediaan fluoresensie-intensiteit (MFI) van glukose-opname (2-NBDG) (A) en mitochondriale aktiwiteit van CD4 + T-selle (MitoTracker donkerrooi) (B) Verteenwoordigende grafieke (links) en getabuleerde data (Regs), CD8 + T-selle en EpCAM + CD45-tumorselle van ascites en tumor. (C) Die verhouding van CD4 + en CD8 + selle (van CD3 + T-selle) in ascites en tumor. (D) Proporsie van EpCAM + tumorselle in ascites en tumor (CD45−). (E en F) EpCAM + CD45-tumor en EpCAM-CD45-matriks glukose-opname (2-NBDG) (E) en mitochondriale aktiwiteit (MitoTracker donkerrooi) (F) verteenwoordigende grafieke (links) en getabuleerde data (Regs) Ascites en tumorselle. (G) Verteenwoordigende grafieke van CD25, CD137 en PD1-uitdrukking deur vloeisitometrie. (H en I) CD25, CD137 en PD1-uitdrukking op CD4 + T-selle (H) en CD8 + T-selle (I). (J en K) Naïewe, sentrale geheue (Tcm), effektor (Teff) en effektorgeheue (Tem) fenotipes gebaseer op die uitdrukking van CCR7 en CD45RO. Verteenwoordigende beelde (links) en tabeldata (regs) van CD4 + T-selle (J) en CD8 + T-selle (K) in ascites en gewasse. P-waardes bepaal deur gepaarde t-toets (*P<0.05, **P<0.01 en ***P<0.001). Die lyn verteenwoordig gepaarde pasiënte (n = 6). FMO, fluoresensie minus een; MFI, mediaan fluoresensie-intensiteit.
Verdere analise het ander beduidende verskille tussen die hoogs opgeloste T-sel fenotipiese status aan die lig gebring. Die geaktiveerde (Figuur 1, G tot I) en effektorgeheue (Figuur 1, J en K) in gewasse is baie meer gereeld as ascites (proporsie van CD3 + T-selle). Net so het die analise van die fenotipe deur die uitdrukking van aktiveringsmerkers (CD25 en CD137) en uitputtingmerkers [geprogrammeerde seldoodproteïen 1 (PD1)] getoon dat hoewel die metaboliese eienskappe van hierdie populasies verskil (Figuur S1, B tot E), geen beduidende metaboliese verskille konsekwent waargeneem is tussen naïewe, effektor- of geheue-subgroepe nie (Figuur S1, F tot I). Hierdie resultate is bevestig deur masjienleermetodes te gebruik om outomaties selfenotipes toe te ken (21), wat verder die teenwoordigheid van 'n groot aantal beenmurgselle (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) in die pasiënt se ascites aan die lig gebring het (Figuur S2A). Onder al die geïdentifiseerde seltipes het hierdie mieloïde selpopulasie die hoogste glukose-opname en mitochondriale aktiwiteit getoon (Figuur S2, B tot G). Hierdie resultate beklemtoon die sterk metaboliese verskille tussen die veelvuldige seltipes wat in ascites en gewasse in HGSC-pasiënte gevind word.
Die grootste uitdaging om die metabonomiese eienskappe van TIL te verstaan, is die behoefte om T-selmonsters van voldoende suiwerheid, kwaliteit en kwantiteit van gewasse te isoleer. Onlangse studies het getoon dat sorterings- en kraalverrykingsmetodes gebaseer op vloeisitometrie kan lei tot veranderinge in sellulêre metabolietprofiele (22-24). Om hierdie probleem te oorkom, het ons die kraalverrykingsmetode geoptimaliseer om TIL van chirurgies geresekeerde menslike eierstokkanker te isoleer en te isoleer voor analise deur LC-MS/MS (sien Materiale en Metodes; Figuur 2A). Om die algehele impak van hierdie protokol op metabolietveranderinge te bepaal, het ons die metabolietprofiele van T-selle wat deur gesonde skenkers geaktiveer is na die bogenoemde kraalskeidingstap vergelyk met selle wat nie kraalgeskei is nie, maar op ys gebly het. Hierdie kwaliteitsbeheer-analise het bevind dat daar 'n hoë korrelasie tussen hierdie twee toestande is (r = 0.77), en die tegniese herhaalbaarheid van die groep van 86 metaboliete het hoë herhaalbaarheid (Figuur 2B). Daarom kan hierdie metodes akkurate metabolietanalise uitvoer in selle wat seltipeverryking ondergaan, en sodoende die eerste hoëresolusieplatform bied vir die identifisering van spesifieke metaboliete in HGSC, waardeur mense 'n dieper begrip van selspesifisiteit van die seksuele metabolismeprogram kan verkry.
(A) Skematiese diagram van magnetiese kraalverryking. Voor analise deur LC-MS/MS, sal die selle drie opeenvolgende rondes van magnetiese kraalverryking ondergaan of op ys bly. (B) Die effek van verrykingstipe op die oorvloed van metaboliete. Die gemiddelde van drie metings vir elke verrykingstipe ± SE. Die grys lyn verteenwoordig 'n 1:1-verhouding. Die intra-klas korrelasie (ICC) van herhaalde metings word in die as-etiket getoon. NAD, nikotienamied adenien dinukleotied. (C) Skematiese diagram van die werkvloei van pasiëntmetabolietanalise. Ascites of gewasse word van pasiënte versamel en kriopreserveer. 'n Klein gedeelte van elke monster is deur vloeisitometrie geanaliseer, terwyl die oorblywende monsters drie rondes van verryking vir CD4+, CD8+ en CD45- selle ondergaan het. Hierdie selsfraksies is met behulp van LC-MS/MS geanaliseer. (D) Hittekaart van gestandaardiseerde metabolietoorvloed. Die dendrogram verteenwoordig Ward se groepering van Euklidiese afstande tussen monsters. (E) Hoofkomponentanalise (HKA) van die monstermetabolietkaart, wat drie replikate van elke monster toon, monsters van dieselfde pasiënt word deur 'n lyn verbind. (F) Die HKA van die metabolietprofiel van die monster gekondisioneer op die pasiënt (d.w.s. met behulp van gedeeltelike redundansie); die monstertipe word beperk deur die konvekse romp. HK1, hoofkomponent 1; HK2, hoofkomponent 2.
Vervolgens het ons hierdie verrykingsmetode toegepas om 99 metaboliete in die CD4+-, CD8+- en CD45-selfraksies in die primêre ascites en gewasse van ses HGSC-pasiënte te analiseer (Figuur 2C, Figuur S3A en Tabel S3 en S4). Die populasie van belang maak 2% tot 70% van die oorspronklike groot monster van lewende selle uit, en die proporsie selle wissel baie tussen pasiënte. Nadat die krale geskei is, maak die verrykte fraksie van belang (CD4+, CD8+ of CD45-) gemiddeld meer as 85% van alle lewende selle in die monster uit. Hierdie verrykingsmetode stel ons in staat om selpopulasies van menslike tumorweefselmetabolisme te analiseer, wat onmoontlik is om van groot monsters te doen. Deur hierdie protokol te gebruik, het ons bepaal dat l-kinurenien en adenosien, hierdie twee goed gekarakteriseerde immuunonderdrukkende metaboliete, verhoog was in tumor-T-selle of tumorselle (Figuur S3, B en C). Daarom demonstreer hierdie resultate die getrouheid en vermoë van ons selskeidings- en massaspektrometrietegnologie om biologies belangrike metaboliete in pasiëntweefsels te vind.
Ons analise het ook 'n sterk metaboliese skeiding van seltipes binne en tussen pasiënte aan die lig gebring (Figuur 2D en Figuur S4A). In die besonder, in vergelyking met ander pasiënte, het pasiënt 70 verskillende metaboliese eienskappe getoon (Figuur 2E en Figuur S4B), wat aandui dat daar aansienlike metaboliese heterogeniteit tussen pasiënte kan wees. Dit is opmerklik dat die totale hoeveelheid ascites wat by pasiënt 70 (80 ml) versamel is, kleiner was in vergelyking met ander pasiënte (1.2 tot 2 liter; Tabel S1). Die beheer van interpasiënt-heterogeniteit tydens hoofkomponentanalise (byvoorbeeld, met behulp van gedeeltelike redundansie-analise) toon konsekwente veranderinge tussen seltipes, en die seltipes en/of mikro-omgewing word duidelik saamgevoeg volgens die metabolietprofiel (Figuur 2F). Die analise van enkele metaboliete het hierdie effekte beklemtoon en beduidende verskille tussen seltipes en mikro-omgewing aan die lig gebring. Dit is opmerklik dat die mees ekstreme verskil wat waargeneem word, MNA is, wat gewoonlik verryk is in CD45- selle en in CD4+ en CD8+ selle wat die gewas infiltreer (Figuur 3A). Vir CD4+-selle is hierdie effek die duidelikste, en die MNA in CD8+-selle blyk ook sterk deur die omgewing beïnvloed te word. Dit is egter nie belangrik nie, want slegs drie van die ses pasiënte kan vir tumor CD8+-tellings geëvalueer word. Benewens MNA, in verskillende tipes selle in ascites en gewasse, is ander metaboliete wat swak gekarakteriseer word in TIL ook differensieel ryk (Figure S3 en S4). Daarom toon hierdie data 'n belowende stel immunomodulerende metaboliete vir verdere navorsing.
(A) Genormaliseerde inhoud van MNA in CD4+, CD8+ en CD45- selle van ascites en tumor. Die boksgrafiek toon die mediaan (lyn), interkwartielreeks (raamskarnier) en data-reeks, tot 1.5 keer die interkwartielreeks (raamsnor). Soos beskryf in Pasiëntmateriaal en Metodes, gebruik die pasiënt se limma-waarde om die P-waarde te bepaal (*P<0.05 en **P<0.01). (B) Skematiese diagram van MNA-metabolisme (60). Metaboliete: S-adenosiel-1-metionien; SAH, S-adenosien-1-homosisteïen; NA, nikotienamied; MNA, 1-metielnikotienamied; 2-PY, 1-metiel-2-piridoon-5-karboksamied; 4-PY, 1-metiel-4-piridoon-5-karboksamied; NR, nikotienamiedribose; NMN, nikotienamiedmononukleotied. Ensieme (groen): NNMT, nikotienamied N-metieltransferase; SIRT, sirtuine; NAMPT, nikotienamiedfosforibosieltransferase; AOX1, aldehiedoksidase 1; NRK, nikotienamiedribosiedkinase; NMNAT, nikotienamiedmono-nukleotied-adenilaattransferase; Pnp1, puriennukleosiedfosforilase. (C) t-SNE van scRNA-seq van ascites (grys) en tumor (rooi; n = 3 pasiënte). (D) NNMT-ekspressie in verskillende selpopulasies geïdentifiseer met behulp van scRNA-seq. (E) Ekspressie van NNMT en AOX1 in SK-OV-3, menslike embrioniese nier (HEK) 293T, T-selle en MNA-behandelde T-selle. Die gevoude ekspressie word relatief tot SK-OV-3 getoon. Die ekspressiepatroon met SEM word getoon (n = 6 gesonde skenkers). Ct-waardes groter as 35 word as onopspoorbaar (UD) beskou. (F) Ekspressie van SLC22A1 en SLC22A2 in SK-OV-3, HEK293T, T-selle en T-selle behandel met 8mM MNA. Die gevoude ekspressie word getoon relatief tot SK-OV-3. Die ekspressiepatroon met SEM word getoon (n = 6 gesonde skenkers). Ct-waardes groter as 35 word as onopspoorbaar (UD) beskou. (G) Sel-MNA-inhoud in geaktiveerde gesonde skenker-T-selle na 72 uur inkubasie met MNA. Die ekspressiepatroon met SEM word getoon (n = 4 gesonde skenkers).
MNA word geproduseer deur die metielgroep van S-adenosiel-1-metionien (SAM) na nikotienamied (NA) oor te dra deur nikotienamied N-metieltransferase (NNMT; Figuur 3B). NNMT word ooruitgedruk in 'n verskeidenheid menslike kankers en word geassosieer met proliferasie, inval en metastase (25-27). Om die bron van MNA in T-selle in TME beter te verstaan, het ons scRNA-seq gebruik om die uitdrukking van NNMT oor seltipes in die ascites en gewasse van drie HGSC-pasiënte te karakteriseer (Tabel S5). Analise van ongeveer 6 500 selle het getoon dat NNMT-uitdrukking in ascites- en tumoromgewings beperk was tot die vermoedelike fibroblast- en tumorselpopulasies (Figuur 3, C en D). Dit is opmerklik dat daar geen duidelike NNMT-uitdrukking in enige populasie is wat PTPRC (CD45 +) uitdruk nie (Figuur 3D en Figuur S5A), wat aandui dat die MNA wat in die metabolietspektrum opgespoor is, in T-selle ingebring is. Die uitdrukking van aldehiedoksidase 1 (AOX1) skakel MNA om na 1-metiel-2-piridoon-5-karboksamied (2-PYR) of 1-metiel-4-piridoon-5-karboksamied (4-PYR); Figuur 3B) is ook beperk tot die populasie van fibroblaste wat COL1A1 uitdruk (Figuur S5A), wat saam aandui dat T-selle nie die vermoë van konvensionele MNA-metabolisme het nie. Die uitdrukkingspatroon van hierdie MNA-verwante gene is geverifieer met behulp van 'n tweede onafhanklike seldatastel van ascites van HGSC-pasiënte (Figuur S5B; n = 6) (16). Daarbenewens het kwantitatiewe polimerase-kettingreaksie (qPCR)-analise van gesonde skenker-T-selle wat met MNA behandel is, getoon dat NNMT of AOX1, in vergelyking met kontrole SK-OV-3-ovariumtumorselle, byna nie uitgedruk is nie (Figuur 3E). Hierdie onverwagte resultate dui daarop dat MNA moontlik van fibroblaste of gewasse in aangrensende T-selle in TME afgeskei kan word.
Alhoewel kandidate die familie van organiese kationtransporteurs 1 tot 3 (OCT1, OCT2 en OCT3) insluit wat deur die oplosbare draer 22 (SLC22) familie (SLC22A1, SLC22A2 en SLC22A3) gekodeer word, is die potensiële transporteurs van MNA steeds ongedefinieerd (28). QPCR van mRNA van gesonde skenker T-selle het lae ekspressievlakke van SLC22A1 getoon, maar onopspoorbare vlakke van SLC22A2, wat bevestig het dat dit voorheen in die literatuur gerapporteer is (Figuur 3F) (29). In teenstelling hiermee het die SK-OV-3 ovariumtumor-sellyn hoë vlakke van beide transporteurs uitgedruk (Figuur 3F).
Om die moontlikheid te toets dat T-selle die vermoë het om vreemde MNA te absorbeer, is gesonde skenker-T-selle vir 72 uur in die teenwoordigheid van verskillende konsentrasies MNA gekweek. In die afwesigheid van eksogene MNA kan die sellulêre inhoud van MNA nie opgespoor word nie (Figuur 3G). Geaktiveerde T-selle wat met eksogene MNA behandel is, het egter 'n dosisafhanklike toename in MNA-inhoud in die selle getoon, tot 6 mM MNA (Figuur 3G). Hierdie resultaat dui daarop dat TIL, ten spyte van die lae vlak van vervoerder-ekspressie en die gebrek aan die hoofensiem wat verantwoordelik is vir intrasellulêre MNA-metabolisme, steeds MNA kan opneem.
Die spektrum van metaboliete in pasiënte se T-selle en in vitro MNA-absorpsie-eksperimente verhoog die moontlikheid dat kanker-geassosieerde fibroblaste (KAF) MNA afskei en tumorselle die fenotipe en funksie van TIL kan reguleer. Om die effek van MNA op T-selle te bepaal, is gesonde skenker-T-selle in vitro geaktiveer in die teenwoordigheid of afwesigheid van MNA, en hul proliferasie en sitokienproduksie is geëvalueer. Na 7 dae van die byvoeging van MNA teen die hoogste dosis, was die populasieverdubbelingsgetal matig verminder, terwyl krag by alle dosisse gehandhaaf is (Figuur 4A). Daarbenewens het behandeling van eksogene MNA gelei tot 'n toename in die proporsie CD4+ en CD8+ T-selle wat tumornekrosefaktor-α (TNFα; Figuur 4B) uitdruk. In teenstelling hiermee was die intrasellulêre produksie van IFN-γ beduidend verminder in CD4+ T-selle, maar nie in CD8+ T-selle nie, en daar was geen beduidende verandering in interleukien 2 (IL-2; Figuur 4, C en D) nie. Daarom het ensiemgekoppelde immunosorbent-toets (ELISA) van supernatante van hierdie MNA-behandelde T-selkulture 'n beduidende toename in TNFα, 'n afname in IFN-γ, en geen verandering in IL-2 getoon nie (Figuur 4, E tot G). Die afname in IFN-γ dui daarop dat MNA 'n rol kan speel in die inhibering van die antitumoraktiwiteit van T-selle. Om die effek van MNA op T-sel-gemedieerde sitotoksisiteit te simuleer, word chimeriese antigeenreseptor T (FRα-CAR-T) selle wat folaatreseptor α en CAR-T (GFP) gereguleer deur groen fluorescerende proteïen (GFP) -CAR-T) selle teiken, geproduseer deur gesonde skenker perifere bloed mononukleêre selle (PBMC). CAR-T selle is vir 24 uur in die teenwoordigheid van MNA gekweek, en dan saam gekweek met menslike SK-OV-3 ovariumtumorselle wat folaatreseptor α uitdruk teen 'n effektor-tot-teiken verhouding van 10:1. MNA-behandeling het gelei tot 'n beduidende afname in die doodmaakaktiwiteit van FRα-CAR-T-selle, wat soortgelyk was aan FRα-CAR-T-selle wat met adenosien behandel is (Figuur 4H).
(A) Totale lewensvatbare seltelling en populasieverdubbeling (PD) direk vanaf kultuur op dag 7. Die staafgrafiek verteenwoordig die gemiddelde + SEM van ses gesonde skenkers. Verteenwoordig data van ten minste n = 3 onafhanklike eksperimente. (B tot D) CD3/CD28 en IL-2 is gebruik om T-selle vir 7 dae teen hul onderskeie MNA-konsentrasies te aktiveer. Voor analise is selle vir 4 uur met PMA/ionomisien met GolgiStop gestimuleer. TNFα (B) uitdrukking in T-selle. Voorbeeldbeeld (links) en tabeldata (regs) van TNFα-uitdrukking in lewende selle. IFN-γ (C) en IL-2 (D) uitdrukking in T-selle. Die uitdrukking van sitokiene is deur vloeisitometrie gemeet. Die staafgrafiek verteenwoordig die gemiddelde (n = 6 gesonde skenkers) + SEM. Gebruik eenrigting-variansie-analise en herhaalde metings (*P<0.05 en **P<0.01) om die P-waarde te bepaal. Verteenwoordig data van ten minste n = 3 onafhanklike eksperimente. (E tot G) CD3/CD28 en IL-2 is gebruik om T-selle vir 7 dae teen hul onderskeie MNA-konsentrasies te aktiveer. Die medium is voor en na 4 uur se PMA/ionomisien-stimulasie versamel. Die konsentrasies van TNFα (E), IFN-γ (F) en IL-2 (G) is deur ELISA gemeet. Die staafgrafiek verteenwoordig die gemiddelde (n = 5 gesonde skenkers) + SEM. P-waarde bepaal deur eenrigting-variansie-analise en herhaalde metings (*P<0.05). Die stippellyn dui die deteksielimiet van die deteksie aan. (H) Sellise-toets. FRα-CAR-T- of GFP-CAR-T-selle is vir 24 uur met adenosien (250 μM) of MNA (10 mM) aangepas, of onbehandeld gelaat (Ctrl). Die persentasie doodmaak van SK-OV-3-selle is gemeet. P-waarde bepaal deur Welch t-toets (*P<0.5 en **P<0.01).
Om 'n meganistiese begrip van MNA-afhanklike TNFα-ekspressieregulering te verkry, is die veranderinge in TNFα mRNA van MNA-behandelde T-selle geëvalueer (Figuur 5A). Gesonde skenker-T-selle wat met MNA behandel is, het 'n tweevoudige toename in TNFα-transkripsievlakke getoon, wat aandui dat MNA afhanklik is van TNFα-transkripsieregulering. Om hierdie moontlike regulatoriese meganisme te ondersoek, is twee bekende transkripsiefaktore wat TNFα reguleer, naamlik geaktiveerde T-selkernfaktor (NFAT) en spesifieke proteïen 1 (Sp1), geëvalueer in reaksie op MNA-binding aan die proksimale TNFα-promotor (30). Die TNFα-promotor bevat 6 geïdentifiseerde NFAT-bindingsplekke en 2 Sp1-bindingsplekke, wat by een plek oorvleuel [-55 basispare (bp) vanaf die 5'-kap] (30). Chromatien-immunopresipitasie (ChIP) het getoon dat wanneer dit met MNA behandel word, die binding van Sp1 aan die TNFα-promotor drievoudig toegeneem het. Die inkorporering van NFAT het ook toegeneem en belangrikheid benader (Figuur 5B). Hierdie data dui daarop dat MNA die uitdrukking van TNFα deur Sp1-transkripsie reguleer, en tot 'n mindere mate die uitdrukking van NFAT.
(A) In vergelyking met T-selle wat sonder MNA gekweek is, die vouverandering van TNFα-uitdrukking in T-selle wat met MNA behandel is. Die uitdrukkingspatroon met SEM word getoon (n = 5 gesonde skenkers). Verteenwoordig data van ten minste n = 3 onafhanklike eksperimente. (B) Die TNFα-promotor van T-selle wat met of sonder 8 mM MNA behandel is nadat NFAT en Sp1 gekombineer is met (Ctrl) en PMA/ionomisien-stimulasie vir 4 uur. Immunoglobulien G (IgG) en H3 is onderskeidelik as negatiewe en positiewe kontroles vir immunopresipitasie gebruik. Die kwantifisering van ChIP het getoon dat die binding van Sp1 en NFAT aan die TNFα-promotor in MNA-behandelde selle verskeie kere toegeneem het in vergelyking met die kontrole. Verteenwoordig data van ten minste n = 3 onafhanklike eksperimente. P-waarde bepaal deur veelvuldige t-toetse (*** P <0.01). (C) In vergelyking met die ascites van HGSC, het T-selle (nie-sitotoksies) verhoogde uitdrukking van TNF in die tumor getoon. Die kleure verteenwoordig verskillende pasiënte. Die vertoonde selle is ewekansig tot 300 gemonster en gejitter om oortrekking te beperk (** Padj = 0.0076). (D) Voorgestelde model van MNA vir eierstokkanker. MNA word in tumorselle en fibroblaste in TME geproduseer en word deur T-selle opgeneem. MNA verhoog die binding van Sp1 aan die TNFα-promotor, wat lei tot verhoogde TNFα-transkripsie en TNFα-sitokienproduksie. MNA veroorsaak ook 'n afname in IFN-γ. Inhibisie van T-selfunksie lei tot verminderde doodmaakvermoë en versnelde tumorgroei.
Volgens berigte het TNFα voor- en agterafhanklike antitumor- en antitumor-effekte, maar dit het 'n bekende rol in die bevordering van die groei en metastase van eierstokkanker (31-33). Volgens berigte is die konsentrasie van TNFα in ascites en tumorweefsel by pasiënte met eierstokkanker hoër as dié in goedaardige weefsels (34-36). Wat meganisme betref, kan TNFα die aktivering, funksie en proliferasie van witbloedselle reguleer, en die fenotipe van kankerselle verander (37, 38). In ooreenstemming met hierdie bevindinge het differensiële geenekspressie-analise getoon dat TNF beduidend opgereguleer was in T-selle in tumorweefsel in vergelyking met ascites (Figuur 5C). Die toename in TNF-ekspressie was slegs duidelik in T-selpopulasies met 'n nie-sitotoksiese fenotipe (Figuur S5A). Opsommend ondersteun hierdie data die siening dat MNA dubbele immuunonderdrukkende en tumorbevorderende effekte in HGSC het.
Fluoreserende etikettering gebaseer op vloeisitometrie het die hoofmetode geword vir die bestudering van TIL-metabolisme. Hierdie studies het getoon dat murine en menslike TIL, in vergelyking met perifere bloedlimfosiete of T-selle van sekondêre limfoïede organe, 'n hoër neiging het om glukose op te neem (4, 39) en die geleidelike verlies van mitochondriale funksie (19, 40). Alhoewel ons soortgelyke resultate in hierdie studie waargeneem het, is die belangrikste ontwikkeling om die metabolisme van tumorselle en TIL van dieselfde geresekeerde tumorweefsel te vergelyk. In ooreenstemming met sommige van hierdie vorige verslae, het tumor (CD45-EpCAM +) selle van ascites en gewasse hoër glukose-opname as CD8 + en CD4 + T-selle, wat ondersteun dat die hoë glukose-opname van tumorselle vergelyk kan word met T-selle. Die konsep van T-selkompetisie. TME. Die mitochondriale aktiwiteit van tumorselle is egter hoër as dié van CD8 + T-selle, maar die mitochondriale aktiwiteit is soortgelyk aan dié van CD4 + T-selle. Hierdie resultate versterk die opkomende tema dat oksidatiewe metabolisme belangrik is vir tumorselle (41, 42). Hulle stel ook voor dat CD8+ T-selle meer vatbaar vir oksidatiewe disfunksie as CD4+ T-selle kan wees, of dat CD4+ T-selle ander koolstofbronne as glukose kan gebruik om mitochondriale aktiwiteit te handhaaf (43, 44). Daar moet kennis geneem word dat ons geen verskil in glukose-opname of mitochondriale aktiwiteit tussen CD4+ T-effektore, T-effektorgeheue en T-sentrale geheueselle in ascites waargeneem het nie. Net so het die differensiasietoestand van CD8+ T-selle in gewasse niks te doen met veranderinge in glukose-opname nie, wat die beduidende verskil tussen T-selle wat in vitro gekweek is en menslike TIL in vivo beklemtoon (22). Hierdie waarnemings is ook bevestig deur die gebruik van onbevooroordeelde outomatiese selpopulasie-allokasie, wat verder aan die lig gebring het dat CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ selle met hoër glukose-opname en mitochondriale aktiwiteit as tumorselle algemeen voorkom, maar 'n metaboliese aktiewe selpopulasie het. Hierdie populasie kan die vermeende subpopulasie van mieloïde onderdrukker-selle of plasmasitoïede dendritiese selle verteenwoordig wat in die scRNA-seq-analise geïdentifiseer is. Alhoewel beide hiervan in menslike ovariumtumore gerapporteer is [45], benodig hulle steeds verdere werk om hierdie myeloïde subpopulasie te beskryf.
Alhoewel vloeisitometrie-gebaseerde metodes die algemene verskille in glukose- en oksidatiewe metabolisme tussen seltipes kan verduidelik, is die presiese metaboliete wat deur glukose of ander koolstofbronne vir mitochondriale metabolisme in TME geproduseer word, nog nie bepaal nie. Die toewysing van die teenwoordigheid of afwesigheid van metaboliete aan 'n gegewe TIL-subgroep vereis suiwering van die selpopulasie uit die uitgesnyde weefsel. Daarom kan ons selverrykingsmetode gekombineer met massaspektrometrie insigte verskaf in die metaboliete wat differensieel verryk is in T-selle en tumorselpopulasies in ooreenstemmende pasiëntmonsters. Alhoewel hierdie metode voordele het bo fluoresensie-geaktiveerde selsortering, kan sekere metabolietbiblioteke beïnvloed word as gevolg van inherente stabiliteit en/of vinnige omsetspoed (22). Nietemin kon ons metode twee erkende immuunonderdrukkende metaboliete, adenosien en kynurenien, identifiseer omdat hulle baie verskil tussen monstertipes.
Ons metabonomiese analise van gewasse en TIL-subtipes bied meer insigte in die rol van metaboliete in ovariële TME. Eerstens, deur middel van vloeisitometrie, het ons bepaal dat daar geen verskil in mitochondriale aktiwiteit tussen gewasse en CD4 + T-selle was nie. LC-MS/MS-analise het egter beduidende veranderinge in die oorvloed van metaboliete onder hierdie populasies aan die lig gebring, wat aandui dat gevolgtrekkings oor TIL-metabolisme en die algehele metaboliese aktiwiteit daarvan noukeurige interpretasie vereis. Tweedens, MNA is die metaboliet met die grootste verskil tussen CD45-selle en T-selle in ascites, nie gewasse nie. Daarom kan kompartementalisering en gewasligging verskillende effekte op TIL-metabolisme hê, wat die moontlike heterogeniteit in 'n gegewe mikro-omgewing beklemtoon. Derdens, die uitdrukking van die MNA-produserende ensiem NNMT is hoofsaaklik beperk tot CAF, wat in 'n mindere mate tumorselle is, maar waarneembare MNA-vlakke word waargeneem in tumor-afgeleide T-selle. Die ooruitdrukking van NNMT in ovariële CAF het 'n bekende kankerbevorderende effek, deels as gevolg van die bevordering van CAF-metabolisme, gewasinsvlaag en metastase (27). Alhoewel die algehele vlak van TIL matig is, is die uitdrukking van NNMT in CAF nou verwant aan die Kankergenoom Atlas (TCGA) mesenkiemale subtipe, wat geassosieer word met swak prognose (27, 46, 47). Laastens is die uitdrukking van die ensiem AOX1 wat verantwoordelik is vir MNA-afbraak ook beperk tot die CAF-populasie, wat aandui dat T-selle nie die vermoë het om MNA te metaboliseer nie. Hierdie resultate ondersteun die idee dat hoewel verdere werk nodig is om hierdie bevinding te verifieer, hoë vlakke van MNA in T-selle die teenwoordigheid van 'n immuunonderdrukkende CAF-mikroomgewing kan aandui.
Gegewe die lae uitdrukkingsvlak van MNA-transporters en die onopspoorbare vlakke van sleutelproteïene betrokke by MNA-metabolisme, is die teenwoordigheid van MNA in T-selle onverwags. Nóg NNMT nóg AOX1 kon opgespoor word deur scRNA-seq-analise en geteikende qPCR van twee onafhanklike kohorte. Hierdie resultate dui daarop dat MNA nie deur T-selle gesintetiseer word nie, maar geabsorbeer word vanaf omliggende TME. In vitro-eksperimente toon dat T-selle geneig is om eksogene MNA op te bou.
Ons in vitro-studies het getoon dat eksogene MNA die uitdrukking van TNFα in T-selle induseer en die binding van Sp1 aan die TNFα-promotor verbeter. Alhoewel TNFα beide antitumor- en antitumorfunksies het, kan TNFα in eierstokkanker die groei van eierstokkanker bevorder (31-33). Die neutralisering van TNFα in eierstoktumorselkultuur of die eliminasie van TNFα-sein in muismodelle kan TNFα-gemedieerde inflammatoriese sitokienproduksie verbeter en tumorgroei inhibeer (32, 35). Daarom kan TME-afgeleide MNA in hierdie geval as 'n pro-inflammatoriese metaboliet optree deur 'n TNFα-afhanklike meganisme deur die outokriene lus, en sodoende die voorkoms en verspreiding van eierstokkanker bevorder (31). Gebaseer op hierdie moontlikheid word TNFα-blokkade bestudeer as 'n potensiële terapeutiese middel vir eierstokkanker (37, 48, 49). Daarbenewens benadeel MNA die sitotoksisiteit van CAR-T-selle tot eierstoktumorselle, wat verdere bewyse lewer vir MNA-gemedieerde immuunonderdrukking. Gesamentlik dui hierdie resultate op 'n model waarin gewasse en CAF-selle MNA in ekstrasellulêre TME afskei. Deur (i) TNF-geïnduseerde ovariumkankergroeistimulasie en (ii) MNA-geïnduseerde T-sel sitotoksiese aktiwiteitsinhibisie, kan dit 'n dubbele tumoreffek hê (Figuur 5D).
Ten slotte, deur 'n kombinasie van vinnige selverryking, enkelselvolgordebepaling en metaboliese profilering toe te pas, het hierdie studie die enorme immunometabolomiese verskille tussen gewasse en askiteselle in HGSC-pasiënte aan die lig gebring. Hierdie omvattende analise het getoon dat daar verskille in glukoseopname en mitochondriale aktiwiteit tussen T-selle is, en het MNA as 'n nie-sel outonome immuunregulerende metaboliet geïdentifiseer. Hierdie data het 'n impak op hoe TME T-selmetabolisme in menslike kankers beïnvloed. Alhoewel die direkte kompetisie vir voedingstowwe tussen T-selle en kankerselle gerapporteer is, kan metaboliete ook as indirekte reguleerders optree om gewasprogressie te bevorder en moontlik endogene immuunresponse te onderdruk. Die verdere beskrywing van die funksionele rol van hierdie regulatoriese metaboliete kan alternatiewe strategieë oopmaak vir die verbetering van die antitumor-immuunrespons.
Pasiëntmonsters en kliniese data is verkry deur die BC-kankergewasweefselbewaarplek wat gesertifiseer is deur die Kanadese Weefselbewaarpleknetwerk. Volgens die protokol wat goedgekeur is deur die BC Kankernavorsingsetiekkomitee en die Universiteit van British Columbia (H07-00463), het alle pasiëntmonsters en kliniese data ingeligte skriftelike toestemming verkry of formeel afstand gedoen van hul toestemming. Die monsters word in die gesertifiseerde BioBank (BRC-00290) gestoor. Gedetailleerde pasiëntkenmerke word in Tabelle S1 en S5 getoon. Vir kriopreservasie word 'n skalpel gebruik om die pasiënt se gewasmonster meganies te ontbind en dit dan deur 'n 100-mikron filter te druk om 'n enkelselsuspensie te verkry. Die pasiënt se ascites is vir 10 minute by 1500 rpm by 4°C gesentrifugeer om die selle te pelleteer en die supernatant te verwyder. Selle verkry van tumor en ascites is kriopreserveer in 50% hitte-geïnaktiveerde menslike AB-serum (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) en 10% dimetielsulfoksied. Hierdie gepreserveerde enkelselsuspensies is ontdooi en gebruik vir metabolomika en metabolietbepaling wat hieronder beskryf word.
Die volledige medium bestaan ​​uit 0.22 μm gefiltreerde 50:50 aangevulde RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamien (Thermo Fisher Scientific) aangevul met 10% hitte-geïnaktiveerde menslike AB serum (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamien (Thermo Fisher Scientific), 1 x Penisillien Streptomisien (PenStrep) oplossing (Thermo Fisher Scientific) en 50 μMB-merkaptoetanol. AimV (Invitrogen) word aangevul met 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) en 2 mM l-glutamien (Thermo Fisher Scientific). Die vloeisitometer kleurbuffer het bestaan ​​uit 0.22μm gefiltreerde fosfaatgebufferde soutoplossing (PBS; Invitrogen) aangevul met 3% hitte-geïnaktiveerde AB menslike serum (Sigma). Die selverrykingsbuffer bestaan ​​uit 0.22μm gefiltreerde PBS en aangevul met 0.5% hitte-geïnaktiveerde menslike AB-serum (Sigma-Aldrich).
In 37°C volledige medium is selle vir 30 minute gekleur met 10 nM MT DR en 100 μM 2-NBDG. Vervolgens is die selle vir 15 minute by 4°C gekleur met lewensvatbaarheidskleurstof eF506. Hersuspendeer die selle in FC Block (eBioscience) en Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), verdun in vloeisitometrie-kleurbuffer (volgens die vervaardiger se instruksies) en inkubeer vir 10 minute by kamertemperatuur. Kleur die selle met 'n stel teenliggaampies (Tabel S2) in vloeisitometrie-kleurbuffer by 4°C vir 20 minute. Hersuspendeer die selle in vloeisitometrie-kleurbuffer (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R-konfigurasie) voor analise. Gebruik SpectroFlo en FlowJo V10 om seltellingdata te analiseer, en gebruik GraphPad Prism 8 om die data te skep. Die mediaan fluoresensie-intensiteit (MFI) van 2-NBDG en MT DR is log-genormaliseer, en toe is 'n gepaarde t-toets gebruik vir statistiese analise om rekening te hou met ooreenstemmende pasiënte. Verwyder alle populasies met minder as 40 gebeurtenisse uit die analise; voer 'n MFI-waarde van 1 in vir enige negatiewe waardes voordat statistiese analise en datavisualisering uitgevoer word.
Om die handmatige poortstrategie van die bogenoemde prosespaneel aan te vul, het ons die volledige annotasie deur die vormbeperkingsboom (FAUST) (21) gebruik om selle outomaties aan die populasie toe te ken nadat dooie selle in FlowJo uitgeskakel is. Ons bestuur die uitvoer handmatig om populasies wat verkeerd toegeken lyk (PD1+ met PD1-tumorselle kombineer) en behoue ​​populasies saam te voeg. Elke monster bevat gemiddeld meer as 2% selle, vir 'n totaal van 11 populasies.
Ficoll-gradiëntdigtheidsentrifugeering is gebruik om PBMC van leukosietskeidingsprodukte te skei (STEMCELL Technologies). CD8+ T-selle is van PBMC geïsoleer met behulp van CD8 MicroBeads (Miltenyi) en vir 2 weke in volledige medium met behulp van TransAct (Miltenyi) uitgebrei volgens die vervaardiger se instruksies. Die selle is vir 5 dae in volledige medium wat IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) bevat, laat staan ​​en toe weer met TransAct gestimuleer. Op dag 7, volgens die vervaardiger se instruksies, is menslike CD45 MicroBeads (Miltenyi) gebruik om selle in drie opeenvolgende rondes te verryk. Die selle is vir vloeisitometrie-analise (soos hierbo beskryf) verdeel, en een miljoen selle is drie keer vir LC-MS/MS-analise verdeel. Die monsters is deur LC-MS/MS verwerk soos hieronder beskryf. Ons het die ontbrekende metabolietwaarde met 'n ioongetal van 1 000 beraam. Elke monster word genormaliseer deur die totale ioongetal (TIC), logaritmies omgeskakel en outomaties genormaliseer in MetaboAnalystR voor analise.
Die enkelsel-suspensie van elke pasiënt is ontdooi en deur 'n 40 μm-filter in volledige medium gefiltreer (soos hierbo beskryf). Volgens die vervaardiger se protokol is drie opeenvolgende rondes van positiewe seleksie deur magnetiese kraalskeiding met behulp van MicroBeads (Miltenyi) gebruik om die monsters vir CD8+-, CD4+- en CD45--selle (op ys) te verryk. Kortliks, die selle word hersuspendeer in selverrykingsbuffer (soos hierbo beskryf) en getel. Die selle is vir 15 minute by 4°C met menslike CD8-krale, menslike CD4-krale of menslike CD45-krale (Miltenyi) geïnkubeer, en dan met selverrykingsbuffer gewas. Die monster word deur die LS-kolom (Miltenyi) gelei, en die positiewe en negatiewe fraksies word versamel. Om die duur te verminder en die selherwinningstap te maksimeer, word die CD8-fraksie dan gebruik vir die tweede ronde van CD4+-verryking, en die CD4-fraksie word gebruik vir die daaropvolgende CD45-verryking. Hou die oplossing op ys dwarsdeur die skeidingsproses.
Om monsters vir metabolietanalise voor te berei, is die selle een keer met yskoue soutoplossing gewas, en 1 ml 80% metanol is by elke monster gevoeg, dan gevortex en vinnig gevries in vloeibare stikstof. Die monsters is aan drie vries-ontdooi siklusse onderwerp en vir 15 minute by 4°C teen 14 000 rpm gesentrifugeer. Die supernatant wat die metaboliete bevat, word verdamp totdat dit droog is. Die metaboliete is weer opgelos in 50 μl 0,03% mieresuur, gevortex om te meng, en dan gesentrifugeer om puin te verwyder.
Ekstraheer metaboliete soos hierbo beskryf. Plaas die supernatant oor na 'n hoëprestasie-vloeistofchromatografiebottel vir metabolomika-navorsing. Gebruik 'n ewekansige behandelingsprotokol om elke monster met 'n soortgelyke aantal selle te behandel om bondeleffekte te voorkom. Ons het 'n kwalitatiewe assessering van globale metaboliete uitgevoer wat voorheen gepubliseer is op die AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupool Mass Spectrometer (50). Chromatografiese analise en piekarea-integrasie is uitgevoer met behulp van MultiQuant weergawe 2.1 sagteware (Applied Biosystems SCIEX).
'n Ioontelling van 1000 is gebruik om die ontbrekende metabolietwaarde te skat, en die TIC van elke monster is gebruik om die genormaliseerde piekarea van elke opgespoorde metaboliet te bereken om te korrigeer vir veranderinge wat deur die instrumentele analise van monsterverwerking ingebring is. Nadat die TIC genormaliseer is, word MetaboAnalystR(51) (standaardparameter) gebruik vir logaritmiese omskakeling en outomatiese normlynskalering. Ons het PCA met vegan R-pakket gebruik om verkennende analise van metaboloomverskille tussen monstertipes uit te voer, en gedeeltelike redundansie-analise gebruik om pasiënte te analiseer. Gebruik die Ward-metode om 'n hittekaart-dendrogram te konstrueer om die Euklidiese afstand tussen monsters te groepeer. Ons het limma (52) op gestandaardiseerde metaboliet-oorvloed gebruik om differensieel oorvloedige metaboliete oor die hele seltipe en mikro-omgewing te identifiseer. Om die verduideliking te vereenvoudig, gebruik ons ​​die groepgemiddelde parameter om die model te spesifiseer, en beskou die seltipes in die mikro-omgewing as elke groep (n = 6 groepe); Vir die betekenistoets het ons drie herhaalde metings vir elke metaboliet uitgevoer. Om vals replikasie te vermy, is die pasiënt as 'n hindernis in die limma-ontwerp ingesluit. Om die verskille in metaboliete tussen verskillende pasiënte na te gaan, het ons die limma-model aangepas om pasiënte op 'n vaste manier in te sluit. Ons rapporteer die betekenis van die voorafgespesifiseerde kontras tussen die seltipe en die mikro-omgewing van Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg-korreksie).
Na kragverryking met behulp van die Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% lewensvatbaarheid), is enkelsel-transkriptome-volgordebepaling uitgevoer op die totale lewende bevrore ascites- en tumormonsters met behulp van 'n 10x 5'-geenekspressieprotokol. Vyf gevalle met ooreenstemmende gewasse en ascites is geanaliseer, hoewel die lae lewensvatbaarheid van een tumormonster die insluiting daarvan verhoed het. Om veelvuldige seleksies van pasiënte te bewerkstellig, het ons die monsters van elke pasiënt in die bane van die 10x chroom-beheerder gekombineer en die ascites- en tumorplekke afsonderlik geanaliseer. Na volgordebepaling [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp gepaarde punt (PE), Quebec-genoom; 'n gemiddeld van 73 488 en 41 378 lesings per sel vir onderskeidelik tumor en ascites]], het ons CellSNP en Vireo (53) gebruik (gebaseer op CellSNP as Die algemene menslike SNP (VCF) wat deur GRCh38 verskaf word, word 'n skenkeridentiteit toegeken. Ons gebruik SNPRelate om die naaste identiteit (IBS) van die pasiënt se genotipe-status (IBS) af te lei, uitgesluit nie-toegewysde selle en selle wat as duplekse geïdentifiseer is en ooreenstemmende skenkers tussen ascites en tumormonsters (54). Op grond van hierdie taak het ons drie gevalle met oorvloedige selvoorstelling in die tumor en ascites vir stroomaf-analise behou. Nadat 'n massafiltrasiestap in die scater (55) en scran (56) BioConductor-verpakking uitgevoer is, het dit 6975 selle (onderskeidelik 2792 en 4183 selle van tumor en ascites) vir analise opgelewer. Ons gebruik igraph se (57) Louvain-groepering van gedeelde naaste buurnetwerk (SNN) gebaseer op Jaccard-afstand na groepselle volgens uitdrukking. Die Trosse is handmatig geannoteer aan vermeende seltipes gebaseer op merkergeen-ekspressie en gevisualiseer met t-SNE. Sitotoksiese T-selle word gedefinieer deur die uitdrukking van CD8A en GZMA, uitgesluit subtrosse met lae ribosomale proteïen-ekspressie. Ons het toegang verkry tot die gepubliseerde data van Izar et al. (16), insluitend hul t-SNE-inbedding, wat die uitdrukkingsoorvleueling tussen immuunselmerkers en NNMT-ekspressie kan beheer.
PBMC is geskei van leukosiet-skeidingsprodukte (STEMCELL Technologies) deur Ficoll-gradiëntdigtheidsentrifugeer. CD3+-selle is geïsoleer van PBMC met behulp van CD3-krale (Miltenyi). In die teenwoordigheid of afwesigheid van MNA, is CD3+-selle geaktiveer met plaatgebonde CD3 (5μg/ml), oplosbare CD28 (3μg/ml) en IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Op die laaste dag van uitbreiding is die lewensvatbaarheid (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) en proliferasie (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) geëvalueer deur vloeisitometrie. Evalueer effektorfunksie deur selle met PMA (20 ng/ml) en ionomisien (1μg/ml) met GolgiStop vir 4 uur te stimuleer, en monitor CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) en TNFα-fluoressien-isotiosianaat (FITC) (MAb11, BD). Stimuleer qPCR- en ChIP-selle met PMA (20 ng/ml) en ionomisien (1μg/ml) vir 4 uur. Die ELISA-supernatant is voor en na stimulasie met PMA (20 ng/ml) en ionomisien (1 μg/ml) vir 4 uur versamel.
Volg die vervaardiger se protokol om RNA te isoleer met behulp van die RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Gebruik QIAshredder (QIAGEN) om die monster te homogeniseer. Gebruik 'n hoëkapasiteit RNA tot cDNA-kit (Thermo Fisher Scientific) om komplementêre DNA (cDNA) te sintetiseer. Gebruik TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) om geenekspressie te kwantifiseer (volgens die vervaardiger se protokol) met die volgende probes: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliseraldehied-3-fosfaat af waterstof (GAPDH)] en Hs01010726_m1 (SLC22A2). Die monsters is op die StepOnePlus intydse PCR-stelsel (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) in die MicroAmp vinnige optiese 96-put reaksieplaat (Applied Biosystems) met MicroAmp optiese film uitgevoer. Enige Ct-waarde wat 35 oorskry, word as bo die deteksiedrempel beskou en word as onopspoorbaar gemerk.
Voer ChIP uit soos voorheen beskryf (58). Kortliks, die selle is behandel met formaldehied (finale konsentrasie 1.42%) en vir 10 minute by kamertemperatuur geïnkubeer. Gebruik aangevulde swellingsbuffer (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl en 0.1% NP-40) op ys vir 10 minute, en resuspendeer dan in immunopresipitasiebuffer soos beskryf (58). Die monster is toe gesonikeer met die volgende siklusse: 10 siklusse (20 1-sekonde pulse) en 'n statiese tyd van 40 sekondes. Inkubeer ChIP-graad immunoglobulien G (Cell Signaling Technology; 1μl), histoon H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) en SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) teenliggaampies met die monster by 4°CC en skud oornag. Inkubeer proteïen A-krale (Thermo Fisher Scientific) met die monster by 4°C met sagte skudding vir 1 uur, gebruik dan chelex-krale (Bio-Rad) om die DNS te verryk, en gebruik proteinase K (Thermo Fisher) vir proteïenvertering. TNFα-promotor is deur PCR opgespoor: vorentoe, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; inteendeel, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp produk). Die beelde is deur Image Lab (Bio-Rad) vervaardig en gekwantifiseer met behulp van ImageJ-sagteware.
Die selkultuursupernatant is versamel soos hierbo beskryf. Die bepaling is uitgevoer volgens die vervaardiger se prosedures van die menslike TNFα ELISA-kit (Invitrogen), menslike IL-2 ELISA-kit (Invitrogen) en menslike IFN-γ ELISA-kit (Abcam). Volgens die vervaardiger se protokol is die supernatant 1:100 verdun om TNFα en IL-2 op te spoor, en 1:3 om IFN-γ op te spoor. Gebruik EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) om absorbansie by 450 nm te meet.
PBMC is geskei van leukosiet-skeidingsprodukte (STEMCELL Technologies) deur Ficoll-gradiëntdigtheidsentrifugeer. CD3+-selle is geïsoleer van PBMC met behulp van CD3-krale (Miltenyi). In die teenwoordigheid of afwesigheid van MNA, is CD3+-selle vir 3 dae geaktiveer met plaatgebonde CD3 (5μg/ml), oplosbare CD28 (3μg/ml) en IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Na 3 dae is die selle versamel en gewas met 0.9% soutoplossing, en die pellet is vinnig gevries. Seltelling is uitgevoer deur vloeisitometrie (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R-konfigurasie) met behulp van 123-telling eBeads.
Ekstrak metaboliete soos hierbo beskryf. Die gedroogde ekstrak is gerekonstitueer teen 'n konsentrasie van 4000 selsekwivalente/μl. Analiseer die monster deur omgekeerde fase-chromatografie (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) en CORTECS T3-kolom (2.1 × 150 mm, deeltjiegrootte 1.6 μm, poriegrootte 120 Å; #186008500, Waters). Polêre massaspektrometer (6470, Agilent), waarin elektrosproei-ionisasie in positiewe modus werk. Mobiele fase A is 0.1% mieresuur (in H2O), mobiele fase B is 90% asetonitriel, 0.1% mieresuur. Die LC-gradiënt is 0 tot 2 minute vir 100% A, 2 tot 7.1 minute vir 99% B, en 7.1 tot 8 minute vir 99% B. Ekwilibreer dan die kolom weer met mobiele fase A teen 'n vloeitempo van 0.6 ml/min vir 3 minute. Die vloeitempo is 0.4 ml/min, en die kolomkamer word verhit tot 50°C. Gebruik MNA se suiwer chemiese standaard (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) om retensietyd (RT) en transformasie vas te stel (RT = 0.882 minute, transformasie 1 = 137→94.1, transformasie 2 = 137→92, Omskakeling 3 = 137→78). Wanneer al drie oorgange teen die korrekte retensietyd plaasvind, word oorgang 1 gebruik vir kwantifisering om spesifisiteit te verseker. Die standaardkurwe van MNA (Toronto Research Chemical Company) is gegenereer deur ses reeksverdunnings van die voorraadoplossing (1 mg/ml) om standaarde van onderskeidelik 0.1, 1.0, 10 en 100 ng/ml en 1.0 en 10μg/ml vloeistof te verkry. Die deteksielimiet is 1 ng/ml, en die lineêre respons is tussen 10 ng/ml en 10μg/ml. Elke inspuiting van twee mikroliter monster en standaard word gebruik vir LC/MS-analise, en 'n gemengde kwaliteitskontrolemonster word elke agt inspuitings uitgevoer om die stabiliteit van die analiseplatform te verseker. Die MNA-response van alle MNA-behandelde selmonsters was binne die lineêre reeks van die toets. Data-analise is gedoen met behulp van MassHunter kwantitatiewe analise sagteware (v9.0, Agilent).
Die tweede generasie αFR-CAR-konstruk is geneem uit Song et al. (59). Kortliks bevat die konstruk die volgende inhoud: CD8a-leiervolgorde, menslike αFR-spesifieke enkelketting-veranderlike fragment, CD8a-skarnier- en transmembraanstreek, CD27-intrasellulêre domein en CD3z-intrasellulêre domein. Die volledige CAR-volgorde is deur GenScript gesintetiseer en toe gekloon in die tweede generasie lentivirale ekspressievektor stroomop van die GFP-ekspressiekasset wat gebruik is om die transduksie-doeltreffendheid te evalueer.
Lentivirus word geproduseer deur transfeksie van HEK293T-selle [American Type Culture Collection (ATCC); gekweek in Dulbecco se gemodifiseerde Eagle-medium wat 10% fetale beeserum (FBS) en 1% PenStrep bevat, en gebruik CAR-GFP-vektor en Die verpakkingsplasmiede (psPAX2 en pMD2.G, Addgene) gebruik lipofeksieamien (Sigma-Aldrich). Die virusbevattende supernatant is 48 en 72 uur na transfeksie versamel, gefiltreer en gekonsentreer deur ultrasentrifugering. Bêre die gekonsentreerde virale supernatant by -80°C tot transduksie.
PBMC word geskei van gesonde donor-leukosietskeidingsprodukte (STEMCELL Technologies) deur Ficoll-gradiëntdigtheidsentrifugeer. Gebruik positiewe seleksie CD8-mikrokrale (Miltenyi) om CD8+-selle van PBMC te isoleer. Stimuleer T-selle met TransAct (Miltenyi) en in TexMACS-medium [Miltenyi; aangevul met 3% hitte-geïnaktiveerde menslike serum, 1% PenStrep en IL-2 (300 U/ml)]. Vier-en-twintig uur na stimulasie is T-selle getransduseer met lentivirus (10 μl gekonsentreerde virussupernatant per 106 selle). 1 tot 3 dae na transduksie op Cytek Aurora (op FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), evalueer die GFP-uitdrukking van die selle om 'n transduksie-effektiwiteit van ten minste 30% te demonstreer.
CAR-T-selle is vir 24 uur in Immunocult (STEMCELL Technologies; aangevul met 1% PenStrep) gekweek onder die volgende toestande: onbehandeld, behandel met 250 μM adenosien of 10 mM MNA. Na voorbehandeling is CAR-T-selle met PBS gewas en gekombineer met 20 000 SK-OV-3-selle [ATCC; in McCoy 5A-medium (Sigma-Aldrich) aangevul met 10% FBS en 1% PenStrep teen 10: Die effektor-tot-teikenverhouding van 1 is in drievoud in aangevulde Immunocult-medium versterk. SK-OV-3-selle en SK-OV-3-selle geliseer met digitalis-saponien (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) is onderskeidelik as negatiewe en positiewe kontroles gebruik. Na 24 uur van ko-kweek is die supernatant versamel en die laktaatdehidrogenase (LDH) gemeet volgens die vervaardiger se instruksies (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Die LDH-supernatant is 1:50 in LDH-buffer verdun. Die persentasie doodmaak is gemeet met behulp van die volgende formule: persentasie doodmaak = persentasie korreksie / maksimum doodmaaktempo x 100%, waar persentasie korreksie = ko-kultuur-slegs T-selle, en maksimum doodmaaktempo = positiewe kontrole-negatiewe kontrole.
Soos beskryf in die teks of materiaal en metodes, gebruik GraphPad Prism 8, Microsoft Excel of R v3.6.0 vir statistiese analise. Indien veelvuldige monsters van dieselfde pasiënt versamel word (soos ascites en tumor), gebruik ons ​​'n gepaarde t-toets of sluit die pasiënt as 'n ewekansige effek in 'n lineêre of veralgemeende model in, soos toepaslik. Vir metabolomika-analise word die belangrikheidstoets in drievoud uitgevoer.
Vir aanvullende materiaal vir hierdie artikel, sien asseblief http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Hierdie is 'n ooptoegangartikel wat versprei word onder die bepalings van die Creative Commons Attribution-Nie-Kommersiële Lisensie, wat die gebruik, verspreiding en reproduksie in enige medium toelaat, solank die finale gebruik nie vir kommersiële gewin is nie en die uitgangspunt is dat die oorspronklike werk korrek is. Verwysing.
Let wel: Ons vra jou slegs om jou e-posadres te verskaf sodat die persoon wat jy aanbeveel vir die bladsy weet dat jy wil hê hulle moet die e-pos sien en dat dit nie strooipos is nie. Ons sal geen e-posadresse vasvang nie.
Hierdie vraag word gebruik om te toets of jy 'n besoeker is en om outomatiese strooipos-indiening te voorkom.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph G. Jones), Russell G. Jones, DeBussell G. Jones. Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA dra by tot die immuunonderdrukking van T-selle en verteenwoordig 'n potensiële immunoterapie-teiken vir die behandeling van menslike kanker.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph G. Jones), Russell G. Jones, DeBussell G. Jones. Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA dra by tot die immuunonderdrukking van T-selle en verteenwoordig 'n potensiële immunoterapie-teiken vir die behandeling van menslike kanker.
©2021 American Association for the Advancement of Science. alle regte voorbehou. AAAS is 'n vennoot van HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.